参慈胶囊联合顺铂对A549/DDP肺腺癌组织MDR1、MRP1、LRP表达的影响
【摘要】 目的：探討参慈胶囊对人肺腺癌A549/DDP裸鼠体内多药耐药相关基因的影响。方法：将50只C57BL/6小鼠接种人肺腺癌细胞A549/DDP细胞悬液建立实体瘤模型，随机分为对照组、参慈胶囊组、参慈胶囊+顺铂组、顺铂组，各10只。对照组予等量生理盐水，其余各组荷瘤小鼠均用药21 d，断颈处死取肿瘤组织，采用FQ-PCR技术检测人肺腺癌A549/DDP肺癌组织MDR1、MRP1、LRP mRNA的表达情况。结果：MDR1 mRNA、MRP1 mRNA、LRP1 mRNA在各组均有表达，各治疗组的MDR1 mRNA、MRP1 mRNA、LRP1 mRNA均低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01）；参慈胶囊+顺铂组的MDR1 mRNA、MRP1 mRNA、LRP1 mRNA的表达均明显低于参慈胶囊组和顺铂组，差异均有统计学意义（P<0.01）。结论：通过降低MDR1、MRP1、LRP多药耐药相关基因的表达，可能是参慈胶囊逆转人肺腺癌A549/DDP裸鼠体内多药耐药的作用机制之一。
【关键词】 肺癌； 参慈胶囊； 顺铂； 多药耐药基因1； 人多药耐药相关蛋白1； 肺耐药相关蛋白
The Effect of Shenci Capsule Combined with Cisplatin on the Expression of MDR1，MRP1 and LRP in A549/DDP Lung Adenocarcinoma Tissues/YU Li-jian，XU Li-qun，LI Zhi-yang，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（24）：001-004
【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Shenci Capsule on human lung adenocarcinoma A549/DDP nude mice multidrug-resistant genes in the body.Method：50 C57BL/6 mice were injected with human lung adenocarcinoma DDP-resistant cell sublines A549/DDP cell suspension to establish solid tumor models and randomly divided into control group，Shenci Capsule group，Shenci Capsule + Cisplatin group，and Cisplatin group，10 mice in each group.The control group was treated with the same amount of normal saline，each group of the rest with tumor-burdened mice were treated with drugs.After 21 d all mice were sacrificed by broken neck and transplanted tumor tissues were cut off，the expression of MDR1，MRP and LRP mRNA in human lung adenocarcinoma A549/DDP tissue were detected by the FQ-PCR technique.Result：MDR1 mRNA，MRP1 mRNA，LRP1 mRNA were expressed in all groups，the levels of MDR1 mRNA，MRP1 mRNA，LRP1 mRNA in the treatment groups were lower than those in the control group，the differences were statistically significant（P<0.01）；the expression of MDR1 mRNA，MRP1 mRNA，LRP1 mRNA in Shenci Capsule + Cisplatin group was lower than those in Shenci Capsule group and Cisplatin group，the differences were statistically significant（P<0.01）.Conclusion：By reducing the MDR1，MRP1 and LRP multi-resistant genes expression，which may is one of the mechanism of action Shenci Capsule reverse human lung adenocarcinoma DDP-resistant cell sublines A549/DDP nude mice multidrug-resistance in the body.
【Key words】 Lung cancer； Shenci Capsule； Cisplatin； Multi-drug resistance 1； Multidrug resistance-associated protein 1； Lung resistance-related protein
First-author’s address：Affiliated Cancer Hospital & Institute of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510095，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.24.001
化疗在非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗手段中占据重要地位，但肿瘤多药耐药（multidrug resistance，MDR）是临床化疗失败最常见和最难克服的问题之一，亦是复发、转移的主要原因，由多种机制参与，寻找逆转化疗耐药的潜在策略已成为肺癌防治的热点[1-2]。参慈胶囊由名方“仙鱼汤”化裁而来，对NSCLC具有较好的疗效，配合化疗具有减毒增效的作用[3]。文献[4]研究显示，参慈胶囊联合顺铂能够通过调节DNA损伤修复系统，改善人肺腺癌A549/DDP裸鼠体内顺铂耐药状态。但多药耐药相关基因是否参与这一过程，目前尚缺乏实验研究。本项目根据参考文献[5]，探讨参慈胶囊联合顺铂对多药耐药基因1（multi-drug resistance 1，MDR1）、人多药耐药相关蛋白1（Multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）、肺耐药相关蛋白（lung resistance-related protein，LRP）表达的影响，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验药物 （1）参慈胶囊组成：党参25 g、山慈菇10 g、仙鹤草15 g、猫爪草30 g、鱼腥草30 g、山海螺30 g、田七片10 g、浙贝15 g、守宫5 g、天冬15 g、炙甘草5 g。由广州一方制药集团提供免煎颗粒，经浓煎、水提，乙醇沉淀，并进一步浓缩而成。（2）顺铂（DDP）（批号：151102）江苏豪森药业股份有限公司，由本院药房提供。
1.2 实验动物 SPF级4～6周龄BALB/c裸鼠50只，体质量18～22 g，雌雄各半，购自广东省医学实验动物中心，动物合格证号为No：44007200010919。
1.3 细胞来源 人肺腺癌耐药细胞A549/DDP由广东省医学实验动物中心提供。
1.4 主要试剂和仪器 胰蛋白酶（美国Sigma公司产品，RT-PCR试剂盒及Trizol（TakaRa公司），PCR扩增仪（美国AB公司产品）。
1.5 引物设计 引物序列根据Genebank人类各目的基因cDNA序列，由广州华银医学检验中心有限公司合成。MDR1：上游引物：TTGGCTGACTTTGCGAAGGA，下游引物：GCAGCGAGAGTTCCCAGAAT，扩增片段大小217 bp。MRP1：上游引物：ACTGTGCTCACGATTGCTCA，下游引物：CGTAGGTTTCCAGGGTTGCT，扩增片段大小242 bp。LRP：上游引物：GCTTCAGCCTGGGAAGTGAT，下游引物：AGCGCGTGGATTCATAAGGT，扩增片段大小422 bp。β-actin：上游引物：CTTCCTTCTTGGGTATGGAATCC，下游引物：GGAGCAATGATCTTGATCTTCATG，扩增片段大小205 bp。
1.6 造模 根据参考文献[5]在无菌条件下取下荷瘤裸鼠瘤块，切成约1 mm3通过穿刺针刺入裸鼠的右前腋下，进行造模。
1.7 分组与处理 根据参考文献[5]接种人肺腺癌细胞A549/DDP瘤块7 d后除去未生成瘤块和瘤块过大的裸鼠，随即分成四组（对照组、参慈胶囊组、顺铂组、参慈胶囊+顺铂组），每组10只。药物浓度根据小鼠公斤体重换算法，其中对照组予以0.2 mL生理盐水灌胃，参慈胶囊组予参慈胶囊药液0.2 mL（110 g/kg）灌胃，顺铂组单纯予顺铂0.02 mg/（20 g·d）腹腔注射，参慈胶囊+顺铂组以参慈胶囊药液0.2 mL（110 g/kg）灌胃，同時予顺铂0.02 mg/（20 g·d），腹腔注射。各组连续用药并观察5周后脱颈处死，分离肿瘤组织，并行病理鉴定。
1.8 检测方法 用荧光定量PCR（FQ-PCR）技术检测MDR1、MRP1、LRPmRNA的表达情况。A549/DDP肺癌组织100 mg匀浆后加入Trizol试剂提取总RNA。使用PE7000全自动荧光定量PCR仪进行目的基因检测，计算每1 μL cDNA所含的基因的拷贝数与1 μL cDNA所含β-actin的拷贝数的比值，进行半定量比较。
1.9 统计学处理 运用SPSS 17.0统计软件，计量数据以（x±s）表示，采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
MDR1 mRNA、MRP1 mRNA、LRP1 mRNA在各组均有表达，各治疗组的MDR1 mRNA、MRP1 mRNA、LRP1 mRNA均低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01）；参慈胶囊+顺铂组的MDR1 mRNA、MRP1 mRNA、LRP1 mRNA的表达均明显低于参慈胶囊组和顺铂组，差异均有统计学意义（P<0.01）。
3 讨论
肺癌发病率和死亡率居全球恶性肿瘤首位，虽然近20年来随着分子靶向药物的迅速发展，肺癌患者从以前的平均生存期由只有7个月左右，提高到2～3年，部分甚至是10年。但最终还是会出现耐药，使得肿瘤复发、进展，其5年生存率仍未见显著提高，约为15%[6-7]。其疗效却已达“平台期”，究其原因，肺癌细胞的多药耐药（MDR）不容忽视，寻找肺癌化疗耐药逆转剂，逆转MDR是肿瘤领域的研究热点。中药活性广泛而显著，高效小毒，多靶点逆转MDR，临床药效逐步得到肯定，但明确的逆转机制尚待研究[8]。
MDR耐药的原因涉及肿瘤细胞对药物的摄取、转运出现障碍，药物在细胞内代谢增加，肿瘤细胞修复增强，药物的作用靶点改变等复杂过程[9-10]。很多研究发现，MDR是由多种耐药蛋白共同组成参与，并有多种耐药相关蛋白一起参与的[11]。目前研究发现导致肺癌多药耐药的基因有10余种，研究较多、较深入的有MDR1、MRP1、LRP等，其通过药物转运的改变，使化疗药物外排增加，导致肿瘤细胞内药物浓度下降，化疗药物难以发挥效果，与肿瘤多药耐药的发生有关。这些耐药基因在非小细胞肺癌多药耐药中可单一发生作用，同时它们之间又有一定的相关性。
MDR-1和其編码的膜糖蛋白（P-gp）在肿瘤细胞过度表达是导致肿瘤多药耐药的主要原因之一，同时MDR-1与P-gp也是目前研究最广泛最深的耐药机制之一。当MDR1在细胞内过表达，使位于细胞膜上的P-gp合成增加，P-gp作为一种能量依赖性“药物泵”，可将细胞内药物泵出细胞外，许多化疗药物在细胞内有效浓度下降，削弱其对肿瘤细胞的杀伤作用而导致耐药的发生[12-13]。本实验结果显示，参慈胶囊+顺铂组较其他各组能够明显降低MDR1 mRNA的表达，差异均有统计学意义（P<0.01）。因此，参慈胶囊通过抑制MDR1的表达，增加顺铂在细胞内蓄积，从而逆转顺铂耐药。
MRP是定位于16号染色体P13.1，编码一种分子量为190 kD的糖蛋白，即MRP蛋白，其导致肿瘤细胞耐药的原理是将药物分离成细胞内的隔离小体，或者把细胞毒物直接排除于细胞外，从而使细胞的靶位点不能与药物直接结合[14]。在肺癌中MRP表达最高的是腺癌，其次是鳞癌，小细胞肺癌的表达要低于非小细胞肺癌，与P-gp不同的是，腺癌中MRP的高水平表达多在低分化的类型中[15]。其中MRP1是研究较多的一种多药耐药基因。MRP1在人体组织中的表达差异性较大，在肺组织中表达最高，MRP1与肺癌多耐药性的关系更为密切。MRP1可作为细胞膜上药物输出泵，可将化疗药物逆浓度外排，使化疗药物在肿瘤细胞内的浓度明显下降，诱发肿瘤细胞产生多药耐药[16-17]。本实验结果显示，参慈胶囊+顺铂组较其他各组能够明显降低MRP1 mRNA的表达，差异均有统计学意义（P<0.01）。因此，参慈胶囊通过抑制MRP1的表达，增加顺铂在肿瘤细胞内的浓度从而逆转顺铂耐药。
LRP位于16号染色体P13.1～P11.2，编码的肺癌耐药性相关蛋白即LRP蛋白含896个氨基酸，分子量为110 kD，主要作用是清除外源性毒性物质，使机体免受损害。LRP的过度表达与恶性肿瘤的耐药发生有关，它是化疗敏感性和生存的独立预后因素，可以使细胞核为靶点的药物不能通过核孔进入细胞核，有些药物即使进入细胞核内也会很快被转运到细胞质中并使细胞质中药物进入运输囊泡，最终通过胞吐机制排到细胞外[18-20]。本实验结果显示，参慈胶囊+顺铂组较其他各组能够明显降低LRP mRNA的表达，差异均有统计学意义（P<0.01）。因此，参慈胶囊通过抑制LRP的表达，进而抑制胞吐机制，增加肿瘤细胞内的药物浓度逆转顺铂耐药。
综上所述，多药耐药相关基因的表达增强，是导致顺铂耐药的重要原因，参慈胶囊通过影响多药耐药相关基因，通过抑制MDR1、MRP1、LRP基因的表达，以逆转人肺腺癌A549/DDP裸鼠体内铂类耐药的状态，可能是参慈胶囊逆转肺癌铂类耐药的作用机制之一。
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（收稿日期：2017-03-01） （本文编辑：张爽）
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