黄连-葛根药对治疗2型糖尿病的网络药理学研究
李吉庆 林道斌 张永杰
摘要 目的：运用网络药理学研究方法对黄连-葛根药对治疗2型糖尿病（T2DM）的作用机制进行分析。方法：采用中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）筛选出黄连-葛根（Coptis Chinensis-Pueraria Lobata，C-P）药对的有效活性成分及作用靶点蛋白，再使用Unipro数据库将筛选出的靶点蛋白转换为基因名，通过GeneCards数据库收集T2DM疾病基因，然后对药物作用基因及疾病相关基因进行韦恩（Venn）分析，寻找交集靶点，用交集靶点与对应活性成分构建活性成分-靶点相互作用网络，并对交集基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。结果：研究得到13个作用于T2DM疾病靶点的活性成分和146个作用靶点，GO功能富集分析确定了284个条目，KEGG通路分析共发现77条作用通路。结论：本研究结果初步探讨了C-P药对治疗T2MD的基本药理作用及其机制，并为进一步的试验研究奠定了良好的基础。
关键词 网络药理学;黄连;葛根;2型糖尿病;作用机制;前列腺素G/H合酶1;前列腺素G/H合酶2;PI3K-Akt信号通路
Mechanisms of the Drug Pair Coptis Chinensis-Pueraria Lobata in the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus Based on Network Pharmacology
LI Jiqing，LIN Daobin，ZHANG Yongjie
（Department of Endocrine，Chinese Medicine Hospital of Hainan Province，Haikou 570203，China）
Abstract Objective：To analyze the mechanism of the drug pair Coptis chinensis-Pueraria lobata in the treatment of type 2 diabetes mellitus（T2MD）by using the method of network pharmacology.Methods：The active components and target proteins of the drug pair Coptis chinensis-Pueraria lobata（C-P）were screened by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），and the target proteins were screened by Unipro database and converted into gene names.The disease gene of T2MD was collected through GeneCards database.Then the drug-acting genes and disease-related genes were analyzed by vnne to find the intersecting targets，with which plus their corresponding active components an active component-target interaction network was constructed.GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of the intersecting genes were also carried out.Results：A total of 13 active components acting on T2MD and 146 effect targets were identified，284 items were identified by GO functional enrichment analysis，and 77 pathways were identified by KEGG pathway analysis.Conclusion：The results of this study preliminarily discussed the basic pharmacological effects and mechanisms of C-P drugs on the treatment of T2MD，and laid a good foundation for further experimental research.
Keywords Network pharmacology; Coptis chinensis; Pueraria lobata; Type 2 diabetes; Mechanism of action; Prostaglandin G / H synthase 1; Prostaglandin G / H synthase 2; PI3K Akt signaling pathway
中图分类号：R282;R587.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.06.007
作为一种常见的慢性疾病，糖尿病在2015年的全球发病已经超过4.15亿，预计在未来30年将达到6.42亿[1]。在我国，糖尿病与心血管病以及肿瘤，已成为威胁人民健康的3大慢性病。在过去的30年里，经过7次全国性调查发现，中国内地的糖尿病患者增长了17倍，其中2型糖尿病患者占比高达90%～95%[2]。所以针对糖尿病，特别是2型糖尿病的药物开发已经日益迫切。最近，由于同時具有安全性、低成本和有效性，中药治疗糖尿病受到了广泛关注[3]，C-P药对就是其中的代表性药物之一。C-P药对是经方葛根芩连汤改善糖脂代谢的主要药对，药效作用等同于全方[4-5]。然而目前对于C-P药对治疗2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）的治疗机制和多从单体成分或单个靶点展开，与中药多成分、多靶点协同治疗机制相悖，这也阻碍了该药对的进一步开发。
近年来网络药理学的兴起，为探索中药治病机制提供了新的方式[6]。网络药理学通过分析“分子-靶点-通路-疾病”的多层次网络的关系，能从整体上阐明中药的作用机制，从部分到系统的解释中药与机体的相互作用。因此，本研究运用网络药理学的研究方式探讨黄连治疗T2DM的作用机制。
1 材料与方法
1.1 C-P药对的活性成分及靶点挖掘
中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）是由西北农林科技大学依托文献挖掘和数据库整合，能够通过研究药物靶标网络和疾病网络，从整体上揭示中药的作用机制[7]。借助TCMSP在线平台获取C-P药对的化学成分，根据口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18，筛选出符合条件的候选化合物其对应靶点，然后在Uniprot数据库[8]，将研究物种限定为“人”，再把获取的靶点转换成对应的基因。
1.2 T2DM相关靶点获取及交集靶点的筛选
以“type 2 diabetes mellitus”为检索词，在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）中搜索T2DM的相关靶点。并与1.1中获取的药物靶点进行Venn分析，获取交集靶点。
1.3 “中药化学成分-作用靶点”网络的构建和分析
运用Cytoscape3.6.1软件构建活性成分-靶点的相互作用网络关系图，再利用软件中的“Network Analyzer”功能对各个节点进行分析，根据化合物与靶点的度值（Dgree）筛选出作用于T2DM的关键化合物及关键作用靶点。
1.4 GO功能分析和KEGG通路富集分析
再将1.2得到的交集基因导入DAVID6.8数据库，并限定研究物种为“Homo Sapiens”，将靶基因名设置为官方名称（Official Gene Symbol），根据错误发现率（FDR）<0.01，进行基因功能（Gene Ontology，GO）分析和基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Geomes，KEGG）通路富集分析。
2 结果
2.1 候选化合物及靶点的筛选结果
在TCMSP根据OB≥30%，DL≥0.18，得到C-P药对有对应靶点的活性成分共15个，对应靶点经过去重后有210个。
2.2 T2DM靶点基因及交集靶点筛选结果
从GeneCards数据库中检索到T2DM相关靶点基因10 320个，与药物靶点进行Venn分析后得到交集靶点146个。
2.3 网络构建及分析结果
将靶點与其对应的活性成分导入Cytoscape3.6.1软件后，建立了一个各个节点联系密切的相互作用网络关系图。见图1～2。在图中共有159个节点，绿色的黄连活性成分节点有10个、黄色的葛根活性成分节点有3个，红色圆形的靶点节点有146个，经过Cytoscape中的Network Analysis-Analyze Network插件对该网络图中的每个节点进行分析，得到网络中各个节点的度值（Degree）。活性成分中，平均每种活性成分对应着21个靶点，度值最高的前5种活性成分分别是槲皮素（Quercetin）、黄连素（Berberine）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol）、芒柄花素（Formononetin）、小檗浸碱（Berlambine）等。见表1。靶点方面，Degree均值约等于2，有39个靶点节点Degree高于均值。见表2。这些靶点能是黄连-葛根治疗T2DM的关键调控靶点，Degree均值最高的5个靶点分别是前列腺素G/H合酶1（PTGS1）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、雄激素受体（AR）、一氧化氮合酶（NOS）。
2.4 GO功能注释及KEGG通路富集分析结果
利用DAVID平台的GO和PATHWAY富集分析功能对146个靶点进行了研究，GO富集分析中根据FDR（错误发现率）<0.01确定了284条GO条目，涉及生物过程的有216条，如对药物反应、转录正调节、细胞老化等。涉及分子功能的有60条如酶结合、RNA聚合酶II转录因子活性、蛋白质活性等。涉及细胞组成的有27条，如细胞外间隙、膜筏、质膜等。同时根据FDR<0.01共找到了77条作用通路，目前有报道的有TNF信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路等。表3，表4分别列举了FDR最小的前20条GO和KEGG通路分析结果。
3 讨论
本研究共发现了黄连-葛根药对的治疗T2DM的13种主要活性成分及146个作用靶点。其中Degree值最高的5种主要成分里，槲皮素能提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，降低促凋亡蛋白Bax的分泌，从而减轻氧化应激导致的胰岛细胞凋亡[9]，并且可以增加MAPK的表达水平与促进MAPK磷酸化，激活胰岛素细胞中的FGF21/MAPK信号通路，有效减轻胰岛素抵抗作用[10]。黄连素同样具有改善胰岛素抵抗作用[11]，还能调节机体糖代谢紊乱[12]，以及保护胰岛细胞[13]。芒柄花素可以通过调控核因子-κB信号通路上游的IKKβ、IκBα，抑制二者高糖环境下的磷酸化，从而减轻由核因子-κB信号通路的活化导致的炎症反应[14]。有研究显示，表小檗碱能显著降低空腹血糖值并改善糖耐量[15]。β-谷甾醇改善微循环，对糖尿病导致的肾脏损害有保护作用[16]。
靶点方面，前列腺素G/H合酶1（PTGS1）和前列腺素G/H合酶2（PTGS2）又称环氧化酶（COX1/2）是将花生四烯酸转化为前列腺素的关键性限速酶，COX1为结构型同工酶，COX2为诱导型同工酶。COX1广泛分布于人体的组织脏器，如胃、肾、血管等。其参与合成的前列腺素对调节肾的血流量、血管舒张起着重要作用，维持着机体的正常生理过程[17]。但COX1在T2DM的疾病过程中扮演的角色目前鲜有报道，研究主要集中在另一种亚型COX2上。由其诱导合成的前列腺素类衍生物，不但会导致糖耐量降低，还会减弱胰岛素敏感性[18-19]。因此抑制COX2的表达，进而减少前列腺素类物质的合成，对治疗T2DM至关重要。
一项前瞻性试验研究显示总睾酮和游离睾酮水平较高者，糖尿病发病率较低[20]。进一步的研究则表明对雄激素低下的老年患者补充睾酮可以有效降低空腹血糖[21]。其机制在于，线粒体功能障碍会影响到机体糖代谢过程，而睾酮可以保护线粒体从而发挥调节糖代谢作用。
PPARG是一类由配体激活的转录因子，目前已发现有3种亚型PPARα，PPARβ，PPARγ等。其中由PPARG编码的PPARγ大量分布于脂肪细胞和免疫细胞中，从促进白色脂肪细胞分化，提高胰岛素受体数目。促进与胰岛素信号传导相关基因的转录，加强胰岛素信号传导。激活与代谢相关蛋白激酶，提高外周组织细胞的葡萄糖转运，减少糖诱导的胰岛素释放等3个途径改善胰岛素抵抗。所以作用于PPARG靶点，可能对胰岛素抵抗有改善作用[22]。
NOS3是APN信号传导通路中的关键分子一氧化氮（NO）的重要合成酶。血管内皮细胞合成的NO不但可松弛血管平滑肌，还可通过抑制白细胞趋化、血小板黏附及低密度脂蛋白的过氧化，改善高糖环境下的血管损伤[23]。所以，活性成分作用于该靶点，可能对血管系统起着保护作用。
通路方面，前20条通路中目前报道与T2DM密切相关的有，乙肝通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路等。研究表明，乙肝患者发生糖尿病的风险远高于常人，这可能与乙肝病毒损伤肝功能导致的肝脏糖代谢异常以及进而产生的胰岛素抵抗有关[24-25]。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是重要的转录调控分子，糖尿病中由其产生的级联反应在血管生成、细胞凋亡等过程中发挥重要作用。高糖环境下HIF-1α分子表达下调，继而导致血管内皮生长因子（VEGF）低表达[26]。这也是糖尿病坏疽的发病机制之一，因为VEGF的表达降低，会导致微循环障碍及血管重构受阻[27]。同时，HIF-1α直接转录调控着抗凋亡因子Bcl-2家族中的Bcl-xL、MCL-1等[28]，糖尿病中HIF-1α蛋白表达下调，将直接导致上述抗凋亡分子分泌降少，最终导致胰岛素B细胞凋亡，这也是糖尿病发生和进展的重要环节[29]。PI3K-Akt信号通路方面，激活后的PI3K，可介导磷脂酰肌醇一磷酸磷酸化为磷脂酰肌醇二磷酸及磷脂酰肌醇三磷酸，并进一步激活Akt。活化的Akt对调节胰岛B细胞数量、大小和胞内的基因转录有着重要影响[30]。周琦等[31]的研究则表明葛根芩连汤可通过激活PI3K-Akt中的上游信号蛋白IRS-2，维持PI3K-Akt通路的活化，继而产生保护胰岛B细胞的作用。
综上所述，本研究通过网络药理学的方法对C-P药对治疗T2DM的作用机制进行了分析，发现了13种可直接作用于T2DM靶点的活性成分以及146个潜在靶点，并通过KEGG通路富集分析确定了77条作用通路，结果与目前文献报道基本吻合，证明了其科学性。同时上述研究成果也給我们进一步的研究指明了方向，为在动物实验中深入探讨C-P药对治疗T2DM的作用机制奠定了基础。
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（2019-10-09收稿 责任编辑：杨觉雄）
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