施用复合微生物肥对当归药材品质的影响
李钦 王引权 彭桐 姚阳阳 令启荣 党昇荣
摘要：采用田间试验比较复合微生物肥料、有机肥和复合肥对当归药材质量的影响，按照《中华人民共和国药典》2015年版四部的方法测定当归水分、总灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含量，采用甲苯法测定当归的多糖含量，采用高效液相色谱法同时测定其阿魏酸、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、正丁基苯酞、藁本内酯和欧当归内酯8种化学成分的含量。结果表明：施用复合微生物肥料可降低当归药材水分、总灰分以及酸不溶性灰分含量，提高浸出物含量;施用有机肥和复合微生物肥料的当归多糖含量高于复合肥。根据主成分分析结果可知，施用有机肥的当归化学成分含量最高。单施复合微生物肥料可提高当归质量，单施有机肥可增加当归药效成分，因此合理配施肥料，可综合提高当归品质及土壤环境安全。
关键词：当归;复合微生物肥料;当归化学成分;多糖;主成分分析
中图分类号：
S567.23+9.06 文献标志码：
A 文章编号：1002-1302（2021）09-0117-06
当归的根具有活血化瘀、调经止痛、润肠通便的功效[1]。近些年当归栽培方面的研究报道增多，其中施肥成为当归栽培方面的关注热点，大量研究发现施用有机肥可提高当归产量及品质，而随着中药材生态种植的兴起，施用生态肥料已成为发展趋势[2-3]。复合微生物肥料由功能各异的微生物和不同营养物质制备而成，具有提高土壤肥力、抑制植物病虫害、增加作物品质、改善作物品质及降低环境污染的功效，兼具菌肥和复合肥料的效果[4-5]。近年来，复合微生物肥料在农业上技术已成熟，但在中药材生态种植方面的施用报道较少。本研究比较复合微生物肥料、有机肥和复合肥不同肥料对当归药材质量的影响，以期为复合微生物肥料在当归生态种植中的应用提供一定的理论依据。
1 试验材料
1.1 试验区概况
试验于2019年4—11月在甘肃省岷县蒲麻镇包家沟村进行，海拔2 500多m，属二阴区坡地。试验地地势较平整，前茬为燕麦。于4月中旬移栽当归前翻地，翻地后抢墒覆膜，膜宽0.6 m，垄间距 30 cm，并按地块条件划定小区。
1.2 试验样品
供试当归种苗选用2018年合作社繁育的当归苗，移栽时按DB62/T 2549—2014《中药材种苗 当归》标准筛选一级苗（茎粗3～5 mm，试验随机取10株当归苗测定苗长、苗鲜质量、茎基直径、分叉数）。挑选好的当归苗用甘肃省绿能农业科技股份有限公司开发的微生物菌剂浸苗15 min后，晾干种苗表皮水分后移栽。供试肥料信息见表1。
1.3 仪器与试剂
高效液相色谱仪（Agilent 1100），购自美国安捷伦;电子天平（BT125D，精密度1/10 000），购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;粉碎机（LG-500A），购自瑞安市百信制药机械厂。
乙腈、冰乙酸、甲醇，均为色谱纯，均购自天津大茂化学试剂公司;阿魏酸对照品（批号H27J7L16718）、洋川芎内酯I对照品（批号P02F9F54166）、洋川芎内酯H对照品（批号P02F9F54165）、洋川芎内酯A对照品（批号P23A9F68613）、正丁基苯酞对照品（批号S09J9D65229）、Z型藁本内酯对照品（批号Y17S9L70462）、欧当归内酯对照品（批号P24A9S68617）、阿魏酸松柏酯对照品（批号Z24D9B78131），均购自上海源叶生物科技有限公司。
1.4 试验设计
采用单因素随机区组设计进行当归不同施肥试验，随机排列，3次重复，每个小区面积2.4 m×12.5 m=30 m2，总占地266.7 m2。试验设4个处理，即有机肥320 kg/667 m2（处理1）、复合微生物肥160 kg/667 m2（处理2）、复合肥50 kg/667 m2（处理3）、不施肥（CK，处理4）。各处理小区除播种前施肥外，生育期间不施肥。各处理田间管理措施一致。
1.5 统计方法
使用Excel 2013 软件进行数据的初步换算和处理，试验数据采用 SPSS 21.0软件进行主成分分析、显著性检验 （P<0.05） 和Duncans多重比较。数据为“平均值±标准差（x±s）”。
2 试验方法
2.1 当归常规项目检查
根据《中华人民共和国药典》2015年版规定，采用通则0832第4法烘干法、通则2302总灰分测定法、通则 2302 酸不溶性灰分测定法以及通则2201醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定各处理当归药材中的水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物含量。
2.2 多糖含量的测定
2.2.1 对照品储备液的制备 称取无水葡萄糖对照品置于105 ℃下干燥，冷却至恒质量后，精确称取无水葡萄糖对照品5.3 mg 放入到50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得葡萄糖对照品储备液。
2.2.2 供试品溶液的制备 精确称定，称取约1 g当归样品粉末（过60目筛），加80%乙醇100 mL回流1 h，过滤后的滤渣再加100 mL的蒸馏水回流 2 h，趁热抽滤，滤液适当浓缩，再加入80%乙醇到滤液中，沉淀，放置过夜，再离心，然后将舍去上清液的沉淀用温水溶解，转移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，再精確量取上述溶液1 mL，置 25 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀即得。
2.3 HPLC法测定当归中8种化学成分的含量
2.3.1 色谱条件 Merk RP-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为1%乙酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～20 min，19%B;20～60 min，19%～95%B;60～75 min，95%～100%B）;检测波长260、280、300 nm;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;进样量20 μL。在该色谱条件下选择的波长为280 nm，此时色谱峰峰形与分离度良好。利用阿魏酸峰计算理论塔板数，计算能力不低于5 000。
2.3.2 对照品溶液的制备 分别精确称取阿魏酸对照品0.006 45 g、阿魏酸松柏酯0.003 01 g、洋川芎内酯I0.000 75 g、洋川芎内酯H 0.000 72 g、洋川芎内酯A 0.004 23 g、正丁基苯酞0.005 01 g、欧当归内酯0.000 96 g，使用5 mL容量瓶将其分别置于瓶中，定容，称取藁本内酯0.005 43 mg，定容至 1 mL 容量瓶内，摇匀，作为储备液。精确移取洋川芎内酯H储备液0.3 mL、欧当归内酯0.2 mL、藁本内酯储备液1 mL，其余各储备液分别移取0.5 mL于同一容量瓶，加甲醇定容至刻度线，摇匀，制成混合对照品溶液，对照品溶液在注入液相色谱仪前需经0.22 μm微孔滤膜过滤。对照品溶液均在4 ℃条件下储藏。对照品溶液色谱图见图1。
2.3.3 供试品溶液的制备 精确称取当归药材粉末（过2号筛）0.500 g，置于150 mL磨口具塞锥形瓶中，加入70%甲醇溶液20 mL后称其质量，将锥形瓶口密封，稳定置于超声仪器内，在220 W、80 Hz条件下超声40 min，取出冷却至室温称质量，用70%甲醇补足失质量后摇匀，抽取混匀溶液后用0.22 μm微孔滤膜将其过滤，即得到供试品溶液。供试品溶液需在4 ℃条件下储藏。
3 结果与分析
3.1 当归药材水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量测定结果
由表2可知，处理3和处理4之间的水分含量差异不显著，处理3的水分含量最大;總灰分和酸不溶性灰分含量以处理2最低，且处理2总灰分含量与处理1、3具有显著差异（P<0.05）;处理1、2浸出物含量与处理4有显著差异（P<0.05），处理4最低。
3.2 当归多糖含量测定结果
3.2.1 标准曲线的制备 精确量取葡萄糖对照品储备液溶液0.2、0.4、0.6、0.7、0.8 mL，分别置于 10 mL 具塞试管中，再加入蒸馏水至1.0 mL，摇匀，精确加入2.0 mL的5%苯酚溶液，混匀，随即加入7.0 mL的浓硫酸，充分混匀，置沸水浴中加热 20 min，自来水水浴冷却5 min后，设置到490 nm处测量吸光度[6]，以空白溶液为对照。以吸光度（y）对葡萄糖溶液浓度（x）进行线性回归，得回归方程 y=68.461x+0.025 3（r2=0.999 4），线性范围 2.12～8.48 mg/L。
3.2.2 稳定性试验 稳定性试验将处理1下的当归样品按照供试品溶液的制备方法制备，按 “2.2.2”节操作，自“精确量取上述溶液1.0 mL”起，依法显色，并于显色后 0、10、20、30、40、50、60 min 测定吸光度，当归多糖含量的相对标准差（RSD）为3.1%时，表明供试品溶液显色后在1 h内有良好的稳定性。
3.2.3 重复性试验 取处理1下当归样品粉末6份，按照“2.2.2”节的操作方法，制备重复性试验所需的供试品溶液，分别显色后测定吸光度。结果表明重复性良好，多糖含量的RSD均为4.5%。
3.2.4 精密度试验 取“2.2.1”节下0.6 mL的对照品溶液显色后，连续测定6次吸光度，当归多糖吸光度的RSD均为0.8%时，表示本方法有良好的精密度。
3.2.5 回收率试验 取9份各约1 g的处理1下的当归样品粉，精确称定，将其分为3个组，各组分别精确加入干燥至恒质量的葡萄糖对照品5.0、8.0、10.0 mg，测定得当归多糖含量的平均回收率为97.12%，RSD为 2.59%。
3.2.6 样品测定 取各当归样品，按照当归多糖上述方法制备供试品溶液并测定，结果见表3。
3.3 当归中8种化学成分测定结果
3.3.1 线性关系考察 吸取“2.3.2”节混合对照品溶液，将其按照一定浓度梯度进行稀释，配制成6个不同浓度的混合标准品溶液，使用0.22 μm的过滤膜将混合标准溶液进行过滤，然后进行HPLC分析。在“2.3.1”节下，当归样品使用色谱技术条件测定。以峰面积为纵坐标（y）、对照品进样含量为横坐标（x）进行线性回归分析，回归方程及线性范围结果见表4。
3.3.2 重复性试验 精确称取处理1当归粉末0.5 g，分为6份，其测试溶液是按照“2.3.3”节的方法制备的，它是在“2.3.1”节色谱条件下测定计算其峰面积，结果按照出峰时间阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、正丁基苯酞、藁本内酯、欧当归内酯含量的RSD（n=6）依次为3.45%、3.24%、4.64%、0.62%、3.32%、3.29%、3.83%、1.090%，RSD值小于5%，说明该方法具有良好的重复性。
3.3.3 精密度试验 取同一份混合对照品溶液，按照“2.3.1” 节的色谱条件，同一天连续进样测定6次，记录各峰面积，考察仪器精密度。结果显示，阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、正丁基苯酞、藁本内酯、欧当归内酯的精密度RSD（n=6）分别为4.09%、1.06%、3.70%、1.82%、0.54%、0.88%、0.47%、0.55%，均小于5%，表明该仪器精密度良好。
3.3.4 稳定性试验 吸取“2.3.2”节下混合对照品溶液，按照“2.3.1”节色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h测定，记录各成分峰面积，并计算RSD值。各成分峰面积RSD（n=6）值分别为4.97%、2.93%、0.70%、0.16%、1.17%、2.15%、0.09%、2.06%，均小于5%，说明供试品溶液在24 h内有良好的稳定性。
3.3.5 加样回收率测定 称取已知含量的6份当归粉末0.5 g，分别加入一定量的阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、正丁基苯酞、藁本内酯、欧当归内酯。按“2.3.3” 节的方法制备供试品溶液，按“2.6.1”节的方法测定，计算8种待测物质的平均加样回收率，分别为97.49%、100.31%、101.57%、98.27%、101.66%、97.62%、97.01%和97.45%，其RSD分别为3.77%、1.28%、0.65%、1.81%、0.32%、0.66%、0.48%和0.39%，表明该测定方法的准确性较好。
3.3.6 样品测定 精确称取不同施肥处理的当归样品各3份，每份0.5 g，供试品溶液根据“2.3.3”节的方法制备。按照“2.3.1”节的色谱技术条件进行分析测定，计算当归中各成分的含量，测定结果见表5，供试品溶液色谱图见图2。
3.3.7 主成分分析
3.3.7.1 相关性分析 运用SPSS 21.0统计分析软件，对4个不同施肥处理的当归药材中8种成分进行主成分分析，得到主成分的特征值、方差贡献率和累计方差贡献率，结果见表6。以特征值大于1为提取标准，前2个主成分的累计方差贡献率达到94.102%，前2个主成分可以代表当归药材中的大部分信息，主成分载荷值矩阵和主成分得分系数矩阵见表7、表8。根据主成分载荷值矩阵结果可知，主成分1的信息主要由洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、欧当归内酯、正丁基苯酞、阿魏酸松柏酯和洋川芎内酯A组成，主成分2的信息主要由藁本内酯组成。
3.3.7.2 不同施肥处理的当归药材有效成分含量的综合评价 每个因子得分表达式可由其成分得分系数矩阵得到：F1=-0.127x阿魏酸+0.168x洋川芎内酯I+0.171x洋川芎内酯H+0.154x阿魏酸松柏酯+0.145x洋川芎内酯A+0.164x正丁基苯酞-0.065x藁本内酯+0.166x欧当归内酯;F2=0.358x阿魏酸+0.075x洋川芎内酯I+0.120x洋川芎内酯H-0.238x阿魏酸松柏酯+0.221x洋川芎内酯A+0.195x正丁基苯酞 + 0.483x藁本内酯+0.098x欧当归内酯。其中：x为各成分的含量。将各成分的方差贡献率作为权重，以2个主成分对当归药材进行综合评价并对结果进行排序，计算其综合评价的函数为 F=70.698F1+23.404F2，结果见表9。
4 讨论与结论
4.1 不同施肥处理对当归药材水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量的影响
根据《中华人民共和国药典》（2015版）要求，当归水分含量不得超过15.0%，总灰分和酸不溶性灰分含量分别不得超过7.0%和2.0%，醇溶物含量均应超过45.0%。本研究结果表明， 不同施肥条件下当归药材水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物含量差异显著（P<0.05）。药材水分含量过高会引起药材储存等问题的出现，处理1和处理2的当归药材水分含量显著低于处理4和处理3。使用不同灰分含量来判断药材洁净度，处理2的2种不同灰分含量明显低于其他处理，所以施用复合微生物肥料的当归药材的纯度最佳。浸出物含量可作为药材质量判定的指标，药材中浸出物的多少可为药材质量的优劣提供判断价值，处理1和处理2的当归药材浸出物含量均高于其他处理。由此可见，施用复合物微生物肥料可提高当归药材中浸出物含量，同时可降低水分、总灰分和酸不溶性含量。
4.2 不同施肥处理对当归多糖含量的影响
近些年对当归的研究结果显示，多糖作为其主要成分之一，具有提高免疫力、抗氧化、抗辐射、保肝等活性作用[7]。不同施肥处理下当归多糖含量没有太大的差异，表现为处理4>处理1>处理2>处理3，可见单施有机肥和复合微生物肥较常规施肥处理多糖含量高。
4.3 利用主成分分析法评价不同施肥处理对当归中8种化学成分含量的影响
当归化学成分类型多样，其中洋川芎内酯类化合物在抗氧化损伤、抗炎镇痛、舒张血管及细胞毒等方面具有显著的疗效[8]。阿魏酸松柏酯成分具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤和舒张血管等生物活性[9]。
当归挥发油的主要成分为藁本内酯，对脑神经系统有广泛抑制作用，具有改善心血管系统、镇痛、解痉、抗休克、抗炎、保肝、保肾等作用[10]。本试验建立了HPLC法并测定了当归中8种化学成分，结合主成分分析评价4种不同施肥处理下的当归质量[11]。根据HPLC法测定结果发现各化学成分之间分离度良好，再根据主成分分析结果可知，单施有机肥的当归药材质量显著优于其他肥料处理，其结果表现为处理1>处理4>处理3>处理2。
施用其他肥料可提高當归品质，但长期施用肥料可改变土壤理化性状，造成土壤板结，养分降低，而当归药材生长不仅与肥料中各养分不对等相关，还与当年药材指标性成分总体含量不高有关。施用复合微生物肥料的当归药材质量虽不及其他肥料处理，但在改善土壤环境方面有明显优势，可改良土壤结构，提高微生物数量，增强土壤酶活性，提高土壤肥力，是一种绿色生态肥料。复合微生物肥料的营养养分为20%，主要靠有效活菌转化土壤有机质并形成有益菌屏障，保护当归根周围环境安全，长期施用可显出其巨大优势。常规化肥和有机肥总养分含量都大于20%，主要是提高植物的品质及产量，短期可能有不错的效益，但长期施用必然会降低土壤肥力，导致土壤板结、盐渍化等一系列问题。因此，可将复合微生物肥料与有机肥配合使用，将肥料利用最大化，满足对植物品质和安全的双需求。
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