化学发光免疫检验应用进展以及在肿瘤标志物检测中的应用
韦桂海
摘要：化学发光免疫分析法（CLIA）具有灵敏度高、特异性强、分析速度快、线性范围宽、操作简便、不需要十分昂贵的仪器设备等特点。广泛运用于医疗临床诊断和食品安全检测等不同方面，既可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体，又可用于核酸探针的检测。根据放射免疫分析的基本原理，将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反应结合起来，该文综述了化学发光免疫分析法的发展以及在肿瘤标志物检测中的应用的现状，并展望了化学发光免疫分析法的研究前景。
关键词：化学发光免疫分析;发光体系;应用
【中图分类号】 R73 【文献标识码】 A 【文章編号】2107-2306（2022）10--02
化学发光免疫分析法是一种结合化学发光和免疫分析的检测方法，不仅操作简单、检测速度快，而且具备较高的检测灵敏度与特异度。且在各领域均取得了较好的应用效果。化学发光免疫分析检测体系目前已趋于成熟[1]。但在实际临床应用过程中，传统的化学发光免疫分析法往往无法达到大量复杂样品和低分子量毒性样品的测定分析工作，故目前急需对化学发光免疫分析法进行优化，以提升其检测效果。本文旨在综述新型化学发光免疫分析法以及在肿瘤标志物检测中的应用的现状，并展望了化学发光免疫分析法的研究前景。
1.化学发光免疫分析技术的基本原理
化学发光免疫分析含有免疫分析和化学发光分析两个系统部分[2]。免疫分析技术就是使用化学发光物质对分析的抗原抗体复合物进行标记，而化学发光分析技术是指使用氧化剂或酶的发光底物使化学发光物质氧化从而形成一个处于激发态的中间体，根据发光强度使用发光信号测量仪器进行检测。根据化学发光标记物与发光强度的关系，便可以知道内部所发生的化学变化，可利用标准曲线计算出被测物的含量[3]。
CLIA 所使用的标记物可分为三类 ：① 发光免疫分析反应中直接参与发光反应的标记物;② 以能量传递或催化作用参与发光反应的酶标记物;③以能量传递参与氧化反应的非酶标记物。其常用的标记酶主要为碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶（HRP），这两种标记酶都具有自身相应的化学发光底物，在实际临床工作中得到了非常广泛的应用[4]。目前的研究方向毫无疑问必然是向稳定性更好、催化活性更强、发光动力学曲线更符合免疫分析的底物和酶进行开发，必将是化学发光免疫分析方法的一个研究重点。目前科学家通过大量实验得到luminol—H2O2在HRP2A的催化下可以发出强度和持续时间较长的光，而且发光的稳定性非常好[5]。纳米粒子对不同种生物的排斥性较低，同时具有信号放大作用，在生物标记中纳米技术的应用范围广泛。利用金纳米粒子对抗体进行标记，能让luminol—H2O2体系的化学发光强度增强。
2.化学发光免疫分析技术的分类
2.1磁性纳米粒子（MPS）
在化学发光免疫分析技术的免疫分析过程中，分离抗原-抗体免疫复合物较为困难，通常需耗费较长的时间，且操作步骤烦琐，导致其本身费时费力因此性价比较低[6]。该方法通过将磁性微粒引入化学发光免疫分析法中，使其成为免疫反应和分离的固相载体，从而起到减少抗原-抗体免疫复合物分离时间的目的。当磁性微粒与抗体相连后，通过免疫反应即可捕获靶物质，由此形成免疫复合物，受外加磁场作用后，免疫复合物便会发生滞留，进而达到分离的效果，同时，还可降低样品中基质对检测产生的干扰[7]。目前，基于磁性微粒的化学发光免疫分析法在癌胚抗原、甲胎蛋白、皮质醇等物质的检测中已得到了广泛的应用。相关研究表明，相较于化学发光免疫分析法，应用基于磁性微粒的化学发光免疫分析法，不但能减少反应试剂用量，还可缩短反应时间，降低背景值，提高灵敏度[8]。在基于磁性微粒的化学发光免疫分析法中，磁性微粒的表面修饰有利于提高检测效率，其不仅可直接修饰抗体，还可应用于链霉亲和素放大体系、异硫氰酸荧光素的异硫氰酸荧光素-抗异硫氰酸荧光素体系[9]。
2.2金纳米粒子
在实施化学发光免疫分析法检测时，金纳米粒子可对luminol—H2O2发光体系内自由基的产生与电子转移起到较为强力的催化作用，增强化学发光反应，从而进一步提高检测灵敏度。有学者分析了金纳米粒子在化学发光反应中的作用，发现金纳米粒子的引入可使luminol—H2O2发光体系内发光反应的信号强度提升4倍以上，表明金纳米粒子可催化luminol—H2O2发光反应[10]。有研究指出，应用酶标记抗体修饰金纳米粒子后，将其用作反应抗体来检测癌胚抗原，其灵敏度较常规化学发光免疫分析法提升了1000倍以上[11]。由此可知，金纳米粒子的应用不仅可促进自由基的产生及电子转移，而且可作为信号放大载体，增强发光信号，对于增强化学发光免疫技术的灵敏度具有直接的促进作用[12]。
2.3与微阵列芯片技术的联合
化学发光免疫分析将灵敏的化学发光测量技术与高度特异性的免疫反应相结合，用于检测和分析检测到的各种物质。微阵列芯片利用光导原位合成或微点样方法，将核酸片段、肽分子，甚至组织切片、细胞等生物样品等大量生物聚合物有序固化在由高密度二维分子排列组成的载体表面，与标记生物样品中的目标分子发生反应。它通过特定设备实现快速、并行和高效地检测并分析相应信号的强度，以确定样品中目标分子的数量。一些学者对硅烷处理过的玻璃微阵列芯片进行了化学发光免疫分析。在每个检测孔中放置与待测物对应的抗体，引入金纳米粒子实现催化作用，同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原，CA125 和CA153蛋白质，结果显示在48分钟内测试了48个样品，并改善了金纳米粒子的干预[13]。提高信号强度，实现高灵敏度、高通量检测。一些研究人员使用化学发光免疫测定法检测硅烷处理过的玻璃芯片上的CA199蛋白，结果良好[14]。微阵列芯片技术被证明是实现化学发光免疫测定高通量检测的重要技术。
2.4与免疫层析技术的联合
免疫层析的原理是将特异性抗体固定在硝酸纤维素膜的某一区域。当干燥的硝化纤维一端浸入样品（尿液或血清）中时，基于毛细现象，样品会沿着膜向前移动，当它移动到固定抗体的区域时，相应的抗原在样品与抗体特异性结合。如果使用免疫金或免疫酶染色，该区域可以显示一定的颜色以达到特异性免疫诊断。有学者将化学发光免疫分析与免疫层析技术相结合，定量检测沙丁胺醇和莱克多巴胺[15]。首先将酶标莱克多巴胺抗体和沙丁胺醇抗体固定在层析膜的结合区，然后将沙丁胺醇固定在两个检测区-牛血清白蛋白上，然后用莱克多巴胺-牛血清白蛋白固定将样品滴在硝酸纤维素膜的一端，样品流入固定抗体的结合区，使样品中的抗原与抗体结合，多余的未结合的酶标抗体会继续流动并进入检测区域分别结合沙丁胺醇-牛血清白蛋白和莱克多巴胺-牛血清白蛋白。上述整个检测过程不超过20分钟，操作简单，检测速度比较快。
3.化学发光免疫技术在肿瘤标记物检测中的应用
恶性肿瘤对人类健康的威胁日益增强，肿瘤生物标志物的检验对于恶性肿瘤筛查、早期诊断、预后、疗效评估具有重要意义。目前化学发光免疫法广泛应用于肿瘤生物标志物检验。随着纳米金粒子、石墨烯和多碳纳米管等纳米材料，核酸适配体，磁性微球，脂质体，人工模拟酶等的应用，肿瘤生物标志物化学发光免疫法检验取得了较大的进步[16]。
胚胎抗原的表达往往在正常人体内及其微量的存在甚至不存在，而使用CLIA对其进行检测，往往能得到较高的精确度和灵敏度;人绒毛膜促性腺激素作为睾丸癌和绒毛膜上皮癌的标志物，往往高表达于肿瘤个体，而临床研究表明，CLIA在进行该物质的检测时具有较高的精确度和灵敏度。通过使用CLIA来检测tPSA（总前列腺特异性抗原）和fPSA（游离前列腺特异性抗原）可用于区分前列腺癌和良性前列腺增生。糖类抗原（CA）常见类型有CA125，CA199，CA153，分别是卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌的标志物。大量研究表明在诊断卵巢癌时，CLIA是检测CA125较好的方法，可用于区分良性和恶性上皮卵巢肿瘤，有助于疾病的诊断。
此外，随着肿瘤研究的进展，同一肿瘤已发现一种或者多种肿瘤标志物，不同种类或者相同肿瘤的不同组织类型可有共同或者不同的肿瘤标志物，而且由于肿瘤标志物的灵敏度和肿瘤的专一性有限，单纯的检测一项肿瘤标志物有可能造成肿瘤标记物含量低的患者发生错误或者漏检。因此选择特异性高的肿瘤标志物联合检测，可提高诊断的阳性率。
4.结语
化学发光免疫分析技术在医学的临床应用已非常成熟，有取代放射免疫分析技术和酶联免疫分析技术而成为诊断市场上的主流产品的趋势。其能够快速、准确地检测肿瘤标志物的能力有重要的临床应用价值。目前国内用CLIA方法研究肿瘤标志物的相关研究较少。同一个标志物可用不同的方法检测，同一方法可分析不同的肿瘤标志物。CLIA以其高的灵敏度和简便的仪器操作占据优势。
CLIA分析方法灵敏度高，特异性强，方法多样，广泛地用于抗原、抗体和半抗原的免疫测定，其线性范围也较宽，符合生物医学和食品安全快速检测的需要，为生物医学和食品安全提供了一种超微量的无辐射免疫检测手段。随着纳米磁性粒子技术、新型免疫反应增强剂和发光剂的不断研究开发，流动注射化学发光免疫分析法、毛细管电泳化学发光免疫分析法、高效液相色谱化学发光免疫分析法不断开发和完善，化学发光免疫技术在医学方面将会有更广阔的应用前景。
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