盐酸氨溴索注射液微生物限度方法学验证
吴骏鑫 蓝陈陈 于琦
摘要：目的：建立盐酸氨溴索注射液微生物限度检查方法。方法依据《中国药典》2020版四部1105非无菌产品微生物限度检查法：微生物计数法进行方法适用性验证。结果：采用薄膜过滤法，使用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，冲洗量为每膜400ml，适用性试验中各试验菌株的回收率比值均在0.5～2.0范围内，符合实验要求。结论该方法可适用于盐酸氨溴索注射液微生物限度的检查。
关键词：盐酸氨溴索注射液;微生物限度;薄膜过滤法
中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：
Abstract：Objective：To establish a microbial limit test method for Ambroxol Hydrochloride Injection. Methods according to China Pharmacopoeia 2020 edition four 1105non microbial products microbial limit test：
microbial counting method applicability validation. Results The membrane filtration method is adopted， and usepH7. 0 sterile Sodium Chloride Peptone buffer， the flushing volume is 400ml per membrane， and the recovery ratio of each test strain in the applicability test is in the range of 0.5 ～ 2.0， which meets the experimental requirements. Conclusion T The method can be used to check the microbial limit of ambroxol hydrochloride injection.
Key words：
Ambroxol Hydrochloride Injection.;microbial limit test; membrane filtration method
盐酸氨溴索是一种有机化合物，可促进呼吸道内部粘稠分泌物的排除及减少粘液的滞留，因而显著促进排痰。适用于伴有痰液分泌不正常及排痰功能不良的急性、慢性呼吸系统疾病，例如：慢性支气管炎急性加重，喘息型支气管炎、支气管哮喘的祛痰治疗;术后肺部并发症的预发性治疗;早产儿及新生儿婴儿呼吸窘迫綜合症（ARDS）的治疗。
1 仪器与材料
classⅡType A/B3型生物安全柜（美国法玛西亚公司）;XG.1DTE-0.6型脉动真空灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）;LMQ.C-50E型立式灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）;KB115E3.1型低温生化培养箱（BINDER）;LRH-325A型生化培养箱（广东宏泰君科学仪器股份有限公司）;HTY-601型集菌仪（浙江泰林生物技术股份有限公司）。
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基金项目名称（编号）
姓名（出生年—），性别，籍贯，学位，职称，研究方向.（必须提供第一作者信息）
试药
盐酸氨溴索注射液（杭州澳亚生物技术股份有限公司，批号为201G0242，201G0243，201G0244）。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]，黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，均来自浙江食品药品检定研究院，工作菌株为第五代。
胰酪大豆胨琼脂培养基（江苏益玛生物科技有限公司，批号201023-1），沙氏葡萄糖琼脂培养基（自制;批号为201112）;pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号为20201029），0.9%氯化钠注射液（山东齐都药业有限公司;批号为1910282162），聚山梨酯80（国药集团化学试剂有限公司，批号为20190919），上述培养基适用性检查结果均符合2020年版《中国药典》要求。
2方法与结果
2.1菌液制备
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种至胰酪大豆胨琼脂培养基上或胰酪大豆胨液体培养基中，30℃～35℃培养18～24小时。取白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，20℃～25℃培养2～3天。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升不大于100cfu的菌悬液。
将黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20℃～25℃培养5～7天使大量孢子成熟，加3～5ml含0.05%（v/v）聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升不大于100cfu的孢子悬液。
2.2菌液计数
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各不大于100cfu，接种至胰酪大豆胨琼脂培养基上，每株试验菌平行接种两个平皿。铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌置30～35℃培养，培养时间不超过3天，计数;白色念珠菌、黑曲霉置30～35℃培养，培养时间不超过5天，计数。取白色念珠菌、黑曲霉各不大于100cfu，接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，每株试验菌平行接种两个平皿，置20～25℃培养，培养时间不超过5天，计数。结果如下。不同菌种在对应的稀释浓度下，菌落计数均符合规定。
2.3微生物计数方法适用性试验
试验组：取盐酸氨溴索注射液供试液3批每批各7份，每份100ml，加入试验菌液（白色念珠菌、黑曲霉各制备两份，其余试验菌各一份），混匀。每份分别通过装有0.45μm孔径滤膜的集菌器过滤，使每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu，经过每张滤膜的供试品量为100ml。然后每张膜用400ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，过滤。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌贴于胰酪大豆胨琼脂平皿上;白色念珠菌、黑曲霉分别取一份贴于胰酪大豆胨琼脂平皿上，另一份贴于沙氏葡萄糖琼脂平皿上。
供试品对照組：取盐酸氨溴索注射液供试液2份，每份100ml，分别通过装有0.45μm孔径滤膜的集菌器过滤，然后每张膜用400ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，过滤，分别贴于胰酪大豆胨琼脂平皿和沙氏葡萄糖琼脂平皿上。
菌液对照组：以稀释液代替供试液，按试验组操作加入试验菌。
阴性对照组：取试验用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液2份，每份100ml，分别通过装有0.45μm孔径滤膜的集菌器过滤，分别贴于胰酪大豆胨琼脂平皿和沙氏葡萄糖琼脂平皿上。
将TSA平板置培养箱，33.0℃下培养，加有金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的培养3天，加有白色念珠菌、黑曲霉的培养5天，计数结果见表2、表3和表4。
将SDA平板置培养箱，21.5℃下培养5天，计数结果见表5、表6和表7。
由表2至表7可知，试验组的菌回收率均在0.5～2范围内，且阴性对照组无菌生长，即说明供试品的微生物计数的方法适用性试验通过。
3 讨论
根据《中国药典》2020年版四部1105非无菌产品微生物限度检查法，微生物限度检查法可采用平皿法、薄膜过滤法、MPN法。盐酸氨溴索是一种有机化合物能溶于水，且无特殊抑菌性，故采用薄膜过滤法进行微生物限度检查。经验证结果显示，3批供试品组及菌液对照组在使用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗400ml每膜后，回收率在合格范围内符合规定。故盐酸氨溴索注射液可以采用上述验证方法，结果可行且可靠。
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