UPLC-MS/MS法同时测定杞菊地黄胶囊中7种有效成分
王珊 刘红梅 刘兵 谭文波 童巧珍 刘湘丹
〔摘要〕 目的 建立超高效液相色譜-串联质谱（UPLC-MS/MS）同时测定杞菊地黄胶囊中莫诺苷、绿原酸、马钱苷、木犀草苷、丹皮酚、23-乙酰泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇B的含量。方法 采用ACQUITY UPLC[R][○] HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）为色谱柱，乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.3 mL·min-1;采用电喷雾电离源（ESI）、多反应离子监测（MRM）模式对7种有效成分进行测定。结果 每粒杞菊地黄胶囊样品中莫诺苷含量为0.28～0.35 mg，绿原酸含量为0.08～0.11 mg，马钱苷含量为0.30～0.48 mg，木犀草苷含量为0.21～0.48 mg，丹皮酚含量为0.62～0.76 mg，23-乙酰泽泻醇C含量为0.04～0.08 mg，23-乙酰泽泻醇B含量为0.15～0.32 mg。7种有效成分相关系数为0.999 0～1.000 0;平均回收率（n=6）为97.72%～99.12%，RSD为0.61%～2.01%。结论 该方法专属性强、灵敏高、重复性好，适用于杞菊地黄胶囊中莫诺苷、绿原酸、马钱苷、木犀草苷、丹皮酚、23-乙酰泽泻醇C和23-乙酰泽泻醇B 7种有效成分的同时测定。
〔关键词〕 杞菊地黄胶囊;超高效液相色谱-串联质谱;莫诺苷;绿原酸;马钱苷;木犀草苷;丹皮酚;23-乙酰泽泻醇C;23-乙酰泽泻醇B
〔中图分类号〕R284.1 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.12.011
Simultaneous Determination of Seven Effective Components in Qiju Dihuang
Capsule by UPLC-MS/MS
WANG Shan1， LIU Hongmei1， LIU Bing1， TAN Wenbo1， TONG Qiaozhen2， LIU Xiangdan2
（1. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China;
2. College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）
〔Abstract〕 Objective To establish an UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of seven effective components （morroniside， chlorogenic acid， loganin， luteolin-7-O-glucoside， paeonol， 23-acetate alisol C， 23-acetate alisol B） in Qiju Dihuang Capsule. Methods The ACQUITY UPLC[R][○]HSS T3 （100 mm×2.1 mm， 1.8 μm） column was adopted with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%-formic acid with gradient elution at the flow rate of 0.3 mL·min-1. Electrospray ionization （ESI） and multiple reactive ion monitoring （MRM） modes were used to determine the seven active components. Results The contents of morroniside， chlorogenic acid， loganin， luteolin-7-O-glucoside， paeonol， 23-acetate alisol C， 23-acetate alisol B in the samples per capsule were 0.28～0.35， 0.08～0.11， 0.30～0.48， 0.21～0.48， 0.62～0.76， 0.04～0.08， 0.15～0.32 mg. Correlation coefficient values of the 7 active components were among 0.999 0～1.000 0; the average recovery rates were among 97.72%～99.12% （n=6）， and the RSD were among 0.61%～2.01%. Conclusion The method established is specific， sensitive and reproducible， which is suitable for the determination of seven effective components （morroniside， chlorogenic acid， loganin， luteolin-7-O-glucoside， paeonol， 23-acetate alisol C， 23-acetate alisol B） in Qiju Dihuang Capsule.
〔Keywords〕 Qiju Dihuang Capsule; UPLC-MS/MS; morroniside; chlorogenic acid; loganin; luteolin-7-O-glucoside; paeonol; 23-acetate alisol C; 23-acetate alisol B
杞菊地黄胶囊收载于2020年版《中华人民共和国药典》一部，处方系由枸杞子、菊花、熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓和盐泽泻八味药组成，其中枸杞子、菊花、熟地黄为君药，熟地黄滋阴补肾，枸杞子补肾益精、养肝明目;菊花善清利头目、宣散肝经之热。配伍山茱萸养肝涩精，山药补脾固精，两药都可协助熟地黄以充复肾中阴精，共为臣药。又配泽泻泻肾利湿，并防熟地黄之滋腻;牡丹皮清泻肝火，并制山茱萸之温涩;茯苓健脾渗湿，以助山药之补脾，共为佐药。诸药配伍，共凑滋肾养肝的功效，临床主要用于肝肾阴亏、眩晕耳鸣、羞明畏光、迎风流泪、视物昏花等症[1]。现行标准仅对处方中的枸杞子、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓进行了控制，其中含量测定项分别采用不同的高效液相色谱方法对方中臣药酒萸肉和佐药牡丹皮中单个有效成分进行了定量测定，君药菊花、熟地黄以及佐药盐泽泻在现行标准中并未进行控制，故现行标准存在一定的缺陷。本文首次采用高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法同时测定君药菊花中的绿原酸和木犀草苷、臣药酒萸肉中的莫诺苷和马钱苷、佐药牡丹皮中的丹皮酚以及盐泽泻中的23-乙酰泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇C 7种有效成分，建立的方法对杞菊地黄胶囊质量标准的完善具有十分重要的意义。
1 主要仪器与试药
LCMS-8050三重四级杆液相色谱质谱联用仪（日本岛津有限公司）;Mettler Toledo MS105DU电子天平（梅特勒托利多集团）;AS30600B型超声波清洗仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。
莫诺苷（批号：111998-202104，纯度：96.8%）、绿原酸（批号：110753-202018，纯度：96.1%）、马钱苷（批号：111640-201808，纯度：99.0%）、木犀草苷（批号：111720-201810，纯度：93.5%）、丹皮酚（批号：110708-201908，纯度：99.8%）、23-乙酰泽泻醇C（批号：12062-202102，纯度：99.2%）、23-乙酰泽泻醇B（批号：111846-202006，纯度：98.3%）均购自中国食品药品检定研究院;杞菊地黄胶囊共5批，分别来自湖南省湘中制药有限公司（批号分别为190801、191001、191102）和通化茂祥制药有限公司（批号：分别为20201001、20201203）。
水为娃哈哈纯净水;乙腈为色谱纯，美国霍尼韦尔公司;甲醇为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。
2 方法与结果
2.1 溶液制备
混合对照品溶液的制备：分别精密称取莫诺苷、绿原酸、马钱苷、木犀草苷、丹皮酚、23-乙酰泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇B对照品适量，加70%甲醇溶解并制成浓度依次分别为0.204 2、0.200 4、0.216 8、0.212 4、0.240 8、0.200 8、0.207 0 mg·mL-1的單个对照品储备液，分别精密量取对照品储备液适量，用70%甲醇稀释20、25、50、200、400、2000倍，制成系列浓度的混合对照品溶液，即得。
供试品溶液制备：精密称取本品0.3 g，置100 mL量瓶中，加70%甲醇约80 mL，超声处理30 min，放冷，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
2.2 仪器分析条件
2.2.1 液相色谱条件[2] 色谱柱为ACQUITY UPLC[R][○]HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0～12 min，乙腈由3%变至100%;12～17 min，100%乙腈;17～17.1 min，乙腈变为3%;17.1～22 min，维持3%乙腈。流速：0.3 mL/min;柱温：35 ℃。
2.2.2 质谱条件[3-6] 离子源：电喷雾离子源（ESI）;源电压4 KV;氮气流速：3 L·min-1;加热气流速：10 L·min-1;干燥器气流速：10 L·min-1;接口温度：300 ℃;离子传输管温度：250 ℃;加热模块温度：400 ℃;各成分质谱分析参数详见表1，混合对照品溶液和供试品溶液的典型图谱见图1。
2.3 方法学验证
2.3.1 线性关系 分别精密量取“2.1”项下的系列浓度混合对照品溶液3 μL，注入液质联用仪，依法测定。以定量离子的峰面积对浓度进行回归分析绘制标准曲线，回归方程和相关系数见表2。结果表明，7种有效成分在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数r≥0.999 0。
2.3.2 检出限和定量限 精密量取线性最低点的混合对照品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取3 μL注入液质联用仪，记录色谱图，以3倍信噪比估算各组分的检测限，以10倍信噪比估算各组分的定量限，7种有效成分的检测限为0.23～0.52 ng·mL-1，定量限为0.77～1.73 ng·mL-1。各成分检测限、定量限见表2。
2.3.3 重复性试验 精密称取同一杞菊地黄胶囊样品（批号：190801）6份，按“2.1”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.2”项仪器条件下进样测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各组分的含量，结果可知，莫诺苷、绿原酸、马钱苷、木犀草苷、丹皮酚、23-乙酰泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇B平均含量依次分别为0.93、0.27、1.02、0.73、2.06、0.14、0.51 mg·g-1，RSD在0.82%～1.93%，表明方法重复性良好。
2.3.4 精密度试验 取重复性项下的同一供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图，各组分峰面积的RSD在0.98%～1.87%，表明该方法精密度良好。
2.3.5 稳定性试验 取重复性项下的同一供试品溶液，在“2.2”项仪器分析条件下，分别于0、3、5、8、12、18 h进样测定，以各组分的峰面积为指标计算RSD，考察供试品溶液的稳定性。结果各组分峰面积RSD在0.81%～2.04%，表明供试品溶液在18 h内稳定。
2.3.6 加样回收率 取已知含量的供试品（批号：190801）0.15 g，精密称定，共6份，分别精密加入对照品贮备液适量（莫诺苷0.70 mL、绿原酸0.20 mL、马钱苷0.70 mL、木犀草苷0.50 mL、丹皮酚1.20 mL、23-乙酰泽泻醇C 0.10 mL、23-乙酰泽泻醇B 0.40 mL），按“2.1”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率，各组分的平均回收率（n=6）在97.72%～99.12%，RSD在0.61%～2.01%之间，详见表3。
2.4 样品测定
采用上述方法对5批杞菊地黄胶囊中的7种有效成分进行检测。结果5批样品中莫诺苷含量在0.28～0.35 mg·粒-1，绿原酸含量在0.08～0.11 mg·粒-1，马钱苷含量在0.30～0.48 mg·粒-1，木犀草苷含量在0.21～0.48 mg·粒-1，丹皮酚含量在0.62～0.76 mg·粒-1，
23-乙酰泽泻醇C含量在0.04～0.08 mg·粒-1，23-乙酰泽泻醇B含量在0.15～0.32 mg·粒-1。详见表4。
3 讨论
现行法定标准并未对杞菊地黄胶囊的君药菊花及佐药盐泽泻进行质量控制，本文建立的UPLC-MS/MS方法同时测定了君药菊花、臣药酒萸肉、佐药牡丹皮和盐泽泻中7种有效成分，方法简单、快速、重复性好，符合中药制剂的相关分析要求，可用于杞菊地黄胶囊的质量控制，对现行质量标准的完善具有十分重要的意义。
本实验曾尝试将君药枸杞子中的甜菜碱、熟地黄中的地黄苷D纳入本系统同时测定，但因甜菜碱极性较大，在反相色谱柱中基本不保留，并且甜菜碱为小分子物质，干扰较大;而地黄苷D在本系统中一直未找到合适的质谱条件，参考文献报道的质谱条件[7]，对照品和样品中几乎无响应，故以上两种成分不适合在本系统中与其它成分同时测定。
有文献报道，杞菊地黄胶囊及其同系列品种中有效成分的含量测定采用的均为HPLC法[8-12]，并且有采用HPLC法同时测定杞菊地黄口服液中12种成分的报道[13]。但因不同成分在紫外检测器的最大吸收波长不一致，要在同一高效液相色谱系统中同时兼顾不同成分的检测灵敏度比较困难，同时紫外检测器与质谱检测器相比灵敏度低、专属性差，不能有效区分同保留时间的不同物质。而中成药因其处方组成复杂，背景干扰较严重，因此在中成药的质量分析中灵敏度和專属性尤为重要。特别在灵敏度和专属性要求非常高的药物疗效、药动学等相关研究中紫外检测器基本不适用，而本文建立的UPLC-MS/MS法具有灵敏度高和专属性强的特点，不仅可以为杞菊地黄胶囊的质量控制提供技术支撑，也可以为该制剂的药物疗效、药动学等相关研究提供一定的参考。
本文建立的液质联用方法采用的三重四级杆质谱仪作为检测器，具有灵敏度高和专属性强的特点，因此，其不仅可以为杞菊地黄胶囊的质量控制提供技术支撑，也可以为该制剂的药物疗效、药动学等相关研究提供一定的参考。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2020：1007-1008.
[2] 程 健，狄留庆，李俊松，等.UPLC-MS/MS法同时测定通塞脉微丸中10种有效成分[J].中草药，2014，45（5）：659-664.
[3] 杨 娜，刘丰林.LC-MS/MS法同时测定十一味益肾降糖片中马钱苷和莫诺苷的含量[J].中国现代中药，2018，20（3）：341-344.
[4] 吕海鸿，王雪芹，刘乃强，等.HPLC-MS法测定双黄连口服液中木犀草苷和绿原酸的含量并评价二者对成品质量的影响[J].中国药房，2011，22（44）：4204-4207.
[5] 王超众，王萌萌，魏 强，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定蒲公英根和蒲公英叶中4种指标性成分的含量[J].医药导报，2020，39（10）：1404-1408.
[6] 郭延垒，吴明军，赵德璋，等.三重四级杆复合线性离子阱质谱对丹皮酚经大鼠肝微粒体体外代谢产物的分析[J].中国医院药学杂志，2013，33（24）：2011-2015.
[7] 赵新峰，李 平，孙毓庆.熟地黄的高效液相色谱/电喷雾电离-质谱分析[J].药物分析杂志，2007，27（6）：874-876.
[8] 杨心刚，马冠瑞.RP-HPLC测定杞菊地黄胶囊中马钱苷的含量[J].中成药，2008，30（2）：295-296.
[9] 李润泽，常增荣，傅欣彤，等.HPLC法测定杞菊地黄丸中莫诺苷、马钱苷和丹皮酚的含量[J].药物分析杂志，2015，35（2）：351-354.
[10] 潘 莹，郭小龙，陈 勇，等.HPLC法测定杞菊地黄丸中马钱苷、芍药苷和丹皮酚的含量[J].中国药科大学学报，2007，38（2）：133-135.
[11] 罗苑苑.RP-HPLC测定杞菊地黄胶囊中芍药苷的含量[J].广东药学院学报，2004，20（3）：251-252.
[12] 郑风敏，刘会艳.HPLC法测定杞菊地黄丸（浓缩丸）中马钱苷的含量[J].北方药学，2015，12（10）：5-6.
[13] 郑艳萍，王欣玲，李伟东，等.HPLC同时测定杞菊地黄口服液12种成分[J].中草药，2019，50（4）：875-879.
猜你喜欢泽泻绿原色谱宫里的世界ELLE世界时装之苑(2021年10期)2021-10-11对手阅读（高年级）(2020年9期)2020-11-06不同甜叶菊品种叶中绿原酸类成分的比较研究广西植物(2020年5期)2020-07-04泽泻降脂食疗两方农村百事通(2019年17期)2019-10-08衍生瓜环固相微萃取搅拌棒—高效液相色谱测定食品中残留雌激素分析化学(2019年3期)2019-03-30固相萃取—离子色谱测定大气颗粒物的甲胺类及其氧化产物分析化学(2018年4期)2018-11-02泽泻读者·校园版(2018年19期)2018-09-14窄内径多孔层开管柱的制备及在液相色谱中的应用分析化学(2017年12期)2017-12-25HPLC—DAD法同时测定银黄含片中黄芩苷和绿原酸的含量中国民族民间医药·下半月(2014年4期)2014-09-26肥油泄千里 泽泻瘦腿 速成完美铅笔腿女刊·瘦美人(2014年4期)2014-06-10
