雷公藤多苷对类风湿关节炎大鼠Ras/Raf1原癌基因表达的影响
刘玉欣 孙志娟 代荣琴 陈正立 梁闯 范洪
摘要 目的：探究雷公藤多苷對类风湿关节炎大鼠关节血清及组织Ras/Raf1表达的影响。方法：将60只SD大鼠随机分为对照组、模型组和干预组，每组20只。模型组与干预组建立大鼠风湿关节炎模型，干预组用雷公藤多苷干预，对照组和模型组给予等量生理盐水。以足趾肿胀度为模型标准和疗效判定指标，实验终点通过酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测大鼠血清Ras、Raf1以及炎症介质肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）水平，实验终点通过Western Blotting检测大鼠滑膜组织Ras和Raf1蛋白表达量并对大鼠踝关节进行HE染色分析。结果：ELISA结果表明，与对照组比较，模型组血清Ras、Raf1、TNF-α、IL-6显著升高（均P<0.01），与模型组比较，干预组血清Ras、Raf1、TNF-α、IL-6显著降低（均P<0.01）;Western Blotting结果表明：与对照组大鼠比较，模型组大鼠滑膜组织Ras、Raf1显著升高（均P<0.01），与模型组比较，干预组大鼠滑膜组织Ras、Raf1显著降低（均P<0.05）。HE染色表明：与对照组比较，模型组病理总评分升高（P<0.01），与模型组比较，干预组病理总评分下降（P<0.05）。结论：雷公藤多苷可抑制大鼠血清炎症介质释放并降低外周血和关节组织中Ras、Raf1蛋白的表达，起到骨保护作用。
关键词 雷公藤多苷;类风湿关节炎;大鼠;滑膜组织;炎症;病理
Effects of Tripterygium Glycosides on Ras/Raf1 Expression in Rats with Rheumatoid Arthritis
LIU Yuxin1，SUN Zhijuan1，DAI Rongqin3，CHEN Zhengli2，LIANG Chuang1，FAN Hong1
（1 Department of Laboratory，Cangzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Cangzhou 061000，China; 2 Department of Laboratory，the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050023，China; 3 Cangzhou Medical College，Cangzhou 061001，China）
Abstract Objective：To explore the effects of tripterygium glycosides on the expression of Ras/Raf1 in joint serum and tissues of rats with rheumatoid arthritis.Methods：A total of 60 SD rats were randomly divided into a control group（n=20），a model group（n=20） and an intervention group（n=20）.Rat rheumatoid arthritis model was established in model group and intervention group.The intervention group was intervened with tripterygium glycosides，and the control group and model group were given the same amount of normal saline.Take toe swelling as model standard and curative effect judgment index，at the end of the experiment，the rat serum levels of Ras，Raf1，TNF-α and IL-6 were detected by ELISA.At the end of the experiment，the protein expression of Ras and Raf1 in rat synovial tissue was detected by Western Blotting，and the rat ankle joint was analyzed by HE staining.Results：The results of ELISA showed that，compared with the control group，the levels of serum Ras，Raf1，TNF-α and IL-6 in the model group were increased significantly（P<0.01）.Compared with the model group，the levels of serum Ras，Raf1，TNF-α and IL-6 in the intervention group were significantly decreased（P<0.01）.The results of Western Blotting showed that，compared with the control group，Ras and Raf1 in rat synovial tissue in the model group were significantly increased（P<0.01），and compared with the model group，Ras and Raf1 in rat synovial tissue in the intervention group were significantly decreased（P<0.01）.He staining showed that，compared with the control group，the total score of pathology in the model group increased（P<0.01），and compared with the model group，the total score of pathology in the intervention group decreased（P<0.05）.Conclusion：Tripterygium glycosides can inhibit the release of serum inflammatory factors in rats and reduce the expression of Ras and Raf1 protein in peripheral blood and joint tissue of rats，which plays a role in bone protection.
Keywords Tripterygium glycosides; Rheumatoid arthritis; Rats; Synovial tissue; Inflammation; Pathology
中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.011
风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是急性或慢性结缔组织炎症，在临床上较为常见。临床以滑膜组织过度增生、关节和肌肉游走性酸痛、红肿、疼痛为主要特征[1]。膜受体酪氨酸蛋白激酶信号传递途径Ras/Raf/MEK/ERK可以将细胞外信号转导至细胞内，调控细胞的增殖与分化、凋亡与炎症反应等重要生物学功能[2]。雷公藤多苷具有抗炎及抑制细胞免疫和体液免疫等作用，临床多用于风湿热瘀，毒邪阻滞所致的类风湿性关节炎[3]。本研究通过建立大鼠类风湿性关节炎模型，探究雷公藤多苷对类风湿性关节炎大鼠Ras/Raf1表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
8周龄雄性SPF级SD大鼠60只，体质量180～200 g，购于斯贝福生物技术有限公司，许可证号（SCXK 2019-0010）。饲养环境温度20～25 ℃，湿度55%，自由饮食、饮水。实验过程符合我院动物伦理相关标准。
1.1.2 药物
雷公藤多苷（纯度99%;江苏美通制药有限公司，批号：140906）。
1.1.3 试剂与仪器
苏木精-伊红（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：wb1005），IL-6 ELISA Kit（批号：RAB0311）、Ras ELISA试剂盒（批号：ml931446-2）及Raf1 ELISA试剂盒（批号：ml937044-2）均购于酶联生物科技有限公司，Rat TNF-α ELISA Kit（Sigma公司，美国，批号：RAB0479），Anti-Ras抗体（批号：ab52939）、Anti-Raf1抗体（批号：ab181115）、Anti-GAPDH抗体（批号：ab8245）及山羊抗兔二抗（批号：ab150077）购于英国Abcam公司。
MINI-PROTEANTETRA电泳仪器（美国Bio-Rad，型号：1658001），全自动组织包埋机（中国雅博，型号：YAB0400），漂烘片机（中国雅博，型号：YABO200），倒置生物显微镜（北京美华仪科技有限公司，型号：MHY-28651），台式高速冷冻离心机（德国贝克曼，型号：Allegra X-22R）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备
将60只SD大鼠随机分为对照组（n=20）、模型组（n=20）和干预组（n=20）。以0.1 mol/L的乙酸配制为2 g/L的Ⅱ型胶原，全弗佐剂（CFA）与Ⅱ型胶原乙酸溶液等比例混匀，配制1 g/L的Ⅱ型胶原乳化液。取0.6 mL乳化液注射于模型组和干预组大鼠足底部。7 d后，以相同的方法注射乳化液0.3 mL[4]。正常对照组注射等量的生理盐水，以大鼠足趾肿胀度为造模成功标准。
1.2.2 给药方法
造模后干预组给予雷公藤多苷9 mg/kg，灌胃，模型组、对照组等体积生理盐水灌胃，连续3周。
1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 大鼠足肿胀度标准
用游标卡尺测量大鼠右侧后足厚度，肿胀度标准为：足跖厚度（注射后-注射前）/注射前足跖厚度[4]。
1.2.3.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测外周血炎症介质及Ras、Raf1
实验终点大鼠眼眶采血1 mL，采血后立刻分离血清，并按照Ras、Raf1、TNF-α、IL-6 ELISA Kits说明严格操作，酶联检测仪测定吸光度值[5]。
1.2.3.3 Western Blotting实验检测滑膜组织Ras/Raf1蛋白表达
采血后切开膝关节，纵向分离周围软组织，同时完整剥离髌骨下缘滑膜组织，PBS清洗两遍，匀浆后冰上裂解细胞提取总蛋白，蛋白提取后进行SDS-PAGE电泳70 V 10 min，110 V 2 h，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST漂洗4次，每次5 min，加入一抗，4 ℃孵育过夜，二抗常温孵育2 h，TBST漂洗4次，5 min/次，ECL显色，发光仪曝光、拍照[6]，以GAPDH为内参，Image J软件分析Ras、Raf1蛋白相对表达水平。
1.2.3.4 大鼠关节取材及HE染色观察病理变化
分离大鼠后肢踝关节，去除皮毛，去除肌腱组织，在10%的PFA中浸泡固定，10%EDTA脱钙液，重新于10%的多聚甲醛中固定，石蜡包埋、切片，用于HE染色。病理学评分标准：关节周围炎症评分：无炎症细胞浸润评为0分，有0～20个炎症细胞浸润评为1分，有20～50个炎症细胞浸润评为2分，多于50个炎症细胞浸润评为3分;骨破坏评分：正常评为0分，有少量软骨丢失评为1分，骨破坏存在于独立的区域评为2分，骨关节结构完全破坏评为3分;病理总评分标准为：关节周围炎症评分+骨破坏评分[7]。
1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，实验独立重复3次，2组间比较用t检验，多组比较用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 造模后大鼠足趾肿胀度檢测
造模后正常组大鼠精神情况好，毛发光亮。雷公藤多苷组和模型组大鼠出现毛发不光泽，关节出现不同程度红肿，同时伴有不同程度关节变形，足厚度显著高于正常对照组（P<0.05），提示造模成功。见表1。
2.2 各组大鼠血清Ras、Raf1、TNF-α、IL-6表达比较
干预组和模型组与对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.01，P<0.001），而干预组大鼠的Ras、Raf1及炎症介质水平均显著低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.001）。见表2。
2.3 雷公藤多苷对大鼠滑膜组织Ras、Raf1表达的影响
干预组和模型组Ras、Raf1均高于对照组，差异均有统计学意义（均P<0.01），而干预组大鼠的Ras、Raf1水平均显著低于模型组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。见图1。
2.4 雷公藤多苷对大鼠踝关节的影响
HE染色发现，对照组大鼠踝关节没有明显炎症细胞浸润，关节周围无明显的炎症细胞浸润和骨破坏发生。模型组大鼠关节内出现大量炎症细胞浸润，关节面出现不同程度的骨破坏。同时与空白组比较，模型组病理学评分显著升高（P<0.001）。干预组可见少量炎症细胞浸润，滑膜增生，出现少量骨质的破坏，与空白组比较病理学评分下降（P<0.001）。干预组与模型组间病理学评分比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2，表3。
3 讨论
类风湿性关节炎是炎症性的自身免疫疾病，在临床上的表现为滑膜组织过度增生及外周关节炎症反应增加，出现骨组织的进行性破坏，并伴有关节肿痛、畸形，患者部分丧失劳动力，甚至危及生命[8-10]。研究表明，类风湿关节炎在青年及老年人群中发病率较高，并伴有不同的并发症和不同的临床表现[11-13]。雷公藤多苷是一种从雷公藤中提取的物质，具有很好的通络活血、消肿止痛以及解毒祛湿的功效，并且现代药理学认为该药物可以对患者的免疫功能进行调节，有抗菌和抗炎的功效，也在肿瘤的治疗中发挥作用，可以有效地降低患者体内的IL-17、IL-22和TNF-α，提高治疗效果[14-15]。雷公藤多苷可通过抑制炎症细胞和炎症介质的产生，从而缓解类风湿性关节炎病情[16]。
Ras可通过激活Raf1维持细胞增殖、成活和迁移，从而导致滑膜组织病理性增厚，血管翳形成，研究表明Ras还在肿瘤细胞的迁移中发挥重要作用[17]。类风湿关节炎过程中伴随着TNF-α水平的升高，IL-1β、IL-17等大量炎症介质的升高[18-19]，IL-6在肥胖、关节炎、慢性阻塞性肺疾病合并骨质疏松等多种疾病中发挥重要作用[20-24]。本研究证实雷公藤多苷可以降低类风湿性关节炎大鼠外周血炎症介质的表达水平，同时可以抑制Ras/Raf1信号通路，缓解类风湿关节炎引起的炎性病变。同时表明雷公藤多苷可以显著抑制类风湿性关节炎大鼠炎症介质的释放，降低炎症部位局部的炎症反应，从而起到关节保护的作用。本研究通过建立大鼠类风湿性关节炎模型，并给予雷公藤多苷进行干预，结果证实雷公藤多苷可以缓解大鼠足肿胀，降低总病理评分，提示雷公藤多苷具有缓解类风湿性关节炎临床症状的作用[25]。
综上所述，雷公藤多苷可能通过下调外周血Ras、Raf1表达水平及滑膜组织中Ras、Raf1蛋白的表，降低外周血炎症介质释放，起到减少滑膜病变及骨保护的作用。本研究为关节炎性相关疾病的研究提供了理论依据。
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（2021-07-06收稿 责任编辑：杨觉雄）
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