基于气味信息的荆芥穗产地鉴别
张礼欣 于小聪 王泽琨 毛春琴 束雅春
中圖分类号 R282.5 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）18-2203-07
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.18.05
摘 要 目的：建立基于气味信息的不同产地荆芥穗的鉴别方法。方法：采用Heracles Ⅱ型超快速气相电子鼻技术对不同产地荆芥穗进行气味鉴别，根据获取的图谱信息结合AroChemBase数据库、Kovates保留指数定性库进行定性分析;采用Alpha Soft V14.2软件进行主成分分析（PCA）、判别因子分析（DFA）;采用SPSS 22.2软件进行聚类分析（CA）。结果：15批不同产地荆芥穗中共有16个共有峰，经与AroChemBase数据库、Kovates保留指数定性库对比，共得到13个可能存在的成分。不同产地荆芥穗可能存在的成分及感官描述信息基本相同，仅含量存在差别。2号共有峰的色谱峰强度为安徽>甘肃>河南>河北>江苏;6号共有峰的色谱峰强度为安徽>河北>甘肃≈河南>江苏;9号共有峰的色谱峰强度为安徽>甘肃>河南>江苏>河北;13号共有峰的色谱峰强度为安徽≈甘肃>河北>江苏>河南，即代表甲酸甲酯（2号）、α-蒎烯（6号）、3-壬酮（9号）及α-松油醇（13号）这4种成分的色谱峰强度可因产地变化而存在较为显著的差异。
PCA结果显示，前2个主成分的累计贡献率为96.807%。DFA结果显示，判别因子1和判别因子2的贡献率分别为92.089%和3.982%。CA结果显示，当距离为10时，15批样品可聚为3类，B1～B5、J1～J3聚为一类，A1～A3聚为一类，G1、G2、N1、N2聚为一类，与 PCA、DFA结果基本一致。结论：超快速气相电子鼻技术可用于鉴别不同产地的荆芥穗;甲酸甲酯、α-蒎烯、3-壬酮及α-松油醇可能为区分不同产地荆芥穗的关键因素。
关键词 超快速气相电子鼻技术;荆芥穗;不同产地;化学计量学;气味鉴别
Identification of the Origin of Schizonepeta tenusfolia Based on “Odor” Information
ZHANG Lixin1，YU Xiaocong1，WANG Zekun1，MAO Chunqin2，SHU Yachun1，2（1. Dept. of Pharmacy， the Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM， Nanjing 210029， China; 2. School of Pharmacy， Nanjing University of TCM， Nanjing 210023， China）
ABSTRACT OBJECTIVE：
To establish the method for identifying Schizonepeta tenusfolia from different habitats based on odor information. METHODS：
The odor of S. tenusfolia from different habitats were identified by Heracles Ⅱ ultra-fast gas phase electronic nose. Qualitative analysis was conducted according to obtained chromatographic information combined with AroChemBase database and Kovats retention index qualitative database. Principle component analysis （PCA） and discriminant factor analysis （DFA） were conducted by using Alpha Soft V14.2 software， and cluster analysis （CA） was performed with SPSS 22.2 software. RESULTS：
There were 16 common peaks in 15 batches of S. tenusfolia from different habitats. After comparison with AroChemBase database and Kovates retention index qualitative database， a total of 13 possible components were obtained. The possible components and sensory description information of S. tenusfolia from different habitats were basically the same， but only the content was different. The chromatographic peak intensities of common peak No. 2 were in descending order as Anhui > Gansu>Henan>Hebei>Jiangsu， the chromatographic peak intensities of common peak No. 6 were in descending order as Anhui>Hebei>Gansu≈Henan>Jiangsu， the chromatographic peak intensities of common peak No. 9 were in descending order as Anhui>Gansu>Henan>Jiangsu>Hebei， the chromatographic peak intensity of common peak No. 13 were in descending order as Anhui≈Gansu>Hebei>Jiangsu>Henan， which represented the chromatographic peak intensity of methyl formate （peak No. 2）， α-pinene （peak No. 6）， 3-nonone （peak No. 9） and α-terpineol （peak No. 13） were significantly different due to the change of habitats. PCA results showed that the cumulative contribution rate of the first two principal components was 96.807%. Results of DFA showed that contribution rates of discriminant factor 1 and discriminant factor 2 were 92.089% and 3.982%. CA results showed that when the distance was 10， 15 batches of samples could be clustered into 3 categories， B1-B5 and J1-J3 into one category， A1-A3 into one category， G1， G2， N1 and N2 into one category. The results were basically consistent with those of PCA and DFA. CONCLUSIONS：
Ultra-fast gas phase electronic nose technology can be used to identify S. tenusfolia from different habitats rapidly. Methyl formate， α-pinene， 3-nonone and α-terpineol may be the key factors to distinguish S. tenusfolia from different habitats.
KEYWORDS Ultra-fast gas phase electronic nose; Schizone- petae tenusfolia; Different habitats; Chemometrics; Odor identification
荆芥穗为唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥花穗，为临床常用解表药[1]。该药主产于我国江苏、河北、江西等地，其主要化学成分包括挥发油、黄酮、有机酸等[2-5]。现代药理研究表明，荆芥穗具有抗炎、抗病毒、抗补体和抑制肿瘤细胞增殖等作用[6-7]，常用于感冒头痛、咽喉肿痛及多种皮肤疾病的治疗[8]。现阶段关于荆芥穗的研究多侧重于其种质资源、挥发油的种类及成分分析、化学成分的提取等，常结合高效液相色谱法（HPLC）、气质联用法（GC-MS）和扩增片段长度多态性（AFLP）标记等技术对其进行分析[2-4，9]。这些分析方法虽可准确区分不同产地的荆芥穗，但具有样品预处理复杂、过程繁琐、成本高等缺点[10-11]。因此，探寻一种准确客观、简单快速鉴别不同产地荆芥穗的新方法具有重要的实际意义。
《新修本草》云：“离其本土，则质同而效异”[12]。自古以来医家用药就十分重视药材产地，产地不同则质量不一，饮片质量及临床疗效难以保证[13]。有研究指出，“气味”特征与其内在化学成分密切相关，尤其是一些含挥发油的药材，气味明显则药效更佳，如荆芥穗以“色淡黄绿、穗长而密、香气浓、味清凉者为佳”[14]。可见，气味体现了中药材整体性的特点[15]。但人为感官评价因受感官差异和环境的影响，其客观性和准确性难以保证。因此，亟需寻找一种可对气味进行客观评价的方法，以实现中药的快速、准确鉴别。电子鼻是近年快速兴起的一种能够全面客观识别中药整体气味信息的智能感官仪器，电子鼻技术目前已在中药真伪、产地、采收期及炮制品判别等中药领域中得以广泛应用，能较全面、完整、客观地反映中药材的整体气味特征[16-23]。例如，牟倩倩等[16]采用电子鼻技术结合化学计量学方法实现了对南北五味子品种的快速鉴别;刘立轩等[17]采用电子鼻技术建立了不同产地秦艽的鉴别方法;卢一等[18]采用超快速气相电子鼻技术建立了硫熏麦冬与未硫熏麦冬的快速鉴别方法。基于此，本研究采用超快速气相电子鼻技术获取荆芥穗“气味指纹”信息，建立气味指纹图谱，同时结合主成分分析（PCA）、判别因子分析（DFA）、聚类分析（CA）等化学计量学方法对不同产地荆芥穗的气味特征进行分析，使气味成为可量化的指标，以期为不同产地荆芥穗的快速鉴别提供参考。
1 材料
1.1 主要仪器
本研究所用主要仪器有Heracles Ⅱ型超快速气相电子鼻以及配套的火焰离子化检测仪、AroChemBase数据库[Kovates保留指数（RI）定性库]、Alpha Soft V14.2软件、HS-100型自動进样器（法国Alpha MOS公司），HL-350型高速多功能粉碎机（上海塞耐机械有限公司），FA1104N型电子天平（上海菁海仪器有限公司）等。
1.2 药品与试剂
正构烷烃（nC6～nC16）混合对照品（批号A0142930，每100 g混合物中含nC6～nC16共0.02～52.27 g）购自美国Restek公司。
15批荆芥穗饮片均购自河北、安徽、河南等地中药材市场，经南京中医药大学陆兔林教授鉴定为唇形科植物荆芥S. tenuifolia Briq.的干燥花穗。将15批荆芥穗样品粉碎，过二号筛，备用。15批荆芥穗饮片信息来源见表1。
2 方法与结果
2.1 单因素考察
HeraclesⅡ型超快速气相电子鼻为顶空进样装置，当检测条件不同时，所得色谱图可能存在较大差异[21]。为使电子鼻具有良好的分析效果，本研究参考相关文献[18，21-22]，分别对进样量、孵化温度和孵化时间进行单因素考察，以确定最优的检测条件。
2.1.1 进样量 取荆芥穗样品（编号A1）粉末，精密称取0.5 g，设置孵化温度40 ℃、孵化时间20 min，考察不同进样量（500、1 000、1 500、2 000、2 500 ?L）对样品色谱峰峰面积及峰形的影响。结果显示，随着进样量增加，样品峰面积逐渐增大;当进样量增至2 000 ?L时，所得色谱峰峰形适中，故选择进样量为2 000 ?L。
2.1.2 孵化温度 取荆芥穗样品（编号A1）粉末，精密称取0.5 g，设置进样量2 000 ?L、孵化时间20 min，考察不同孵化温度（40、45、50、55、60 ℃）对样品色谱峰峰面积及峰形的影响。结果显示，当孵化温度为50 ℃时，所得色谱峰峰形良好;若继续升高温度，部分色谱峰峰高先增加后减小，且孵化温度过高可对荆芥穗中的气味成分造成一定损耗或由于分离效果不好导致实验结果差异，故选择孵化温度为50 ℃。
2.1.3 孵化时间 取荆芥穗样品（编号A1）粉末，精密称取0.5 g，设置进样量2 000 ?L、孵化温度50 ℃，考察不同孵化时间（10、15、20、25、30 min）对样品色谱峰峰面积及峰形的影响。结果显示，当孵化时间为20 min时，所得色谱峰峰形良好，色谱峰峰面积趋于饱和、稳定，故选择孵化时间为20 min。
2.2 检测条件
本研究所用的色谱柱为低极性MXT-5（10 m×0.18 mm，0.4 ?m）、中极性MXT-1701（10 m×0.18 mm，0.4 ?m）;样品瓶为20 mL，样品量为0.5 g，进样量为2 000 ?L;孵化温度为50 ℃，孵化时间为20 min;进样速度为125 ?L/s，进样持续时间为21 s;进样口温度为200 ℃;捕集阱初始温度为40 ℃，最终温度为240 ℃，分流速度为10 mL/min，捕集时间为26 s;柱温初始温度为50 ℃，程序升温（以1 ℃/s升至80 ℃，以5 ℃/s升至100 ℃，再以1 ℃/s升至180 ℃，最后以5 ℃/s升至250 ℃，保持20 s）;采集时间为150 s;火焰离子化检测仪增益为12。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验 取荆芥穗样品（编号A1）粉末约0.5 g，精密称定，共6份，按“2.2”项下条件进行测定，记录图谱，以峰面积最大的峰为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，16个共有峰相对保留时间的RSD均不高于0.14%（n=6），相对峰面积的RSD均不高于4.99%（n=6），表明方法精密度良好。
2.3.2 重复性试验 取荆芥穗样品（编号A1），分6次粉碎，每次取粉末约0.5 g，精密称定，按“2.2”项下条件进行测定，记录图谱，以峰面积最大的峰为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，16个共有峰相对保留时间的RSD均不高于0.14%（n=6），相对峰面积的RSD均不高于4.86%（n=6），表明方法重复性良好。
2.3.3 稳定性试验 取荆芥穗样品（编号A1）粉末约0.5 g，精密称定，共6份，分别于温度（17±3） ℃、湿度（35±5）%条件下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.2”项下条件进行测定，记录图谱，以峰面积最大的峰为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，16个共有峰相对保留时间的RSD均不高于0.15%（n=6），相对峰面积的RSD均不高于4.89%（n=6），表明样品粉末于上述条件下放置24 h内稳定性良好。
2.4 荆芥穗粉末气味数据分析
分别取15批不同产地荆芥穗样品粉末，按“2.2”项下条件进行测定。除去空白参考后，记录15批荆芥穗样品的图谱信息。将图谱导入Origin 2018函数绘图软件，建立荆芥穗气味特征的指纹图谱，详见图1。由图1可知，不同产地的荆芥穗共有16个共有峰。其中，河北产荆芥穗的气味信息与其他产地的荆芥穗之间存在较为明显的差异，故以河北产荆芥穗为对照，随机选取不同产地的样品各1批（编号分别B1、A1、G1、N1、J1），采用Macromedia Fireworks 8绘图软件绘制镜像对比图（图2），比较两者对应色谱峰的峰面积变化规律，寻找专属性差异。采用正构烷烃（nC6-nC16）混合对照品溶液进行校准后，将15批荆芥穗图谱信息的保留时间（RT）转换为RI，经AroChemBase数据库对比得出定性结果，详见表2。
由图2、表2可知，16个共有峰经与数据库对比得到13个可能存在的化合物（表中筛选出的化合物匹配相似度均大于90%）;不同产地荆芥穗可能存在的成分及感官描述信息基本相同，仅含量存在一定差异。2号共有峰的色谱峰强度为安徽>甘肃>河南>河北>江苏;6号共有峰的色谱峰强度为安徽>河北>甘肃≈河南>江苏;9号共有峰的色谱峰强度为安徽>甘肃>河南>江苏>河北;13号共有峰的色谱峰强度为安徽≈甘肃>河北>江苏>河南，即代表甲酸甲酯（2号）、α-蒎烯（6号）、3-壬酮（9号）及α-松油醇（13号）这4种成分色谱峰的强度可因产地变化而存在较为显著的差异，表明这4个色谱峰可能是区分不同产地荆芥穗的关键因素。
2.5 PCA
PCA 是把多指标转化为少数综合指标的一种多元统计分析方法[24]，其可将所提取的信息进行数据转换和降维，并对降维后的特征向量进行线性分类，最后在分析图上显示主要的二维图[20]。本研究采用超快速气相电子鼻自带的Alpha Soft V14.2软件，将筛选出的区分能力强（>0.900）、峰面积较大（>1 000）且分离度较好的色谱峰作为传感器进行 PCA[23]。结果显示，第1主成分（PC1）的贡献率为88.949%，第2主成分（PC2）的贡献率为7.858%，两个主成分的累计贡献率为96.807%，表明不同产地荆芥穗气味的差异主要由PC1决定。PCA区分指数（DI）为94（DI是电子鼻区分样品程度的表征，DI的最大值为100;80～100表明有效区分，且其值越大表示区分越好[25]）。河南、甘肃及安徽产荆芥穗主要分布于PCA图右边，江苏、河北产荆芥穗主要分布于图左边;相同产地的样品分布较为集中，不同产地的样品离散程度较大，表明不同产地样品的气味差异明显，详见图3。
2.6 DFA
DFA是一种用于构建模型并识别未知样品所属类别的方法[15]。通过数学变换，DFA能够使同类组群数据间的差异尽可能缩小，而不同类组群数据间的差异尽可能扩大，以建立数据识别模型[26]。因此，本研究采用超快速气相电子鼻自带的Alpha Soft V14.2软件进行DFA。结果显示，判别因子1和判别因子2的贡献率分别为92.089%和3.982%;相同产地样品间的距离缩小，不同产地样品间的距离增大，表明不同产地荆芥穗可通过超快速气相电子鼻进行快速鉴别，且区分效果较好，所得趋势及结果与PCA结果一致，详见图4。
2.7 CA
CA是将数据聚集到不同的类或者簇的一个过程，同一个簇中的对象有很大的相似性，而不同簇的对象有很大的相异性[24]。CA的目标是在相似的基础上收集数据并分类[27]。本研究参考相关文献[28-30]，采用SPSS 22.2软件以13个共有峰峰面积为变量，以平方欧式距離为测度，以组间连接法进行CA。结果显示，当距离为10时，15批荆芥穗可聚为3类，B1～B5、J1～J3聚为一类，A1～A3聚为一类，G1、G2、N1、N2聚为一类，该结果与 PCA、DFA结果基本一致，详见图5。
3 讨论
超快速气相电子鼻作为一种新型的气味分析仪器，具有检测灵敏度高和响应时间短等优点[20]。该仪器不仅可将所得色谱峰作为传感器，而且还可将RT换算成RI，经正构烷烃校准后，通过AroChemBase数据库进行定性分析[31]。与传统型电子鼻相比，气相输出信号取代了传统型电子鼻有限的传感信号，能够得到更多的化合物信息，同时能够通过RI的定性分析来获取一些未知化合物的气味信息，有助于对其性质的深入研究[32]。化学计量学方法可对所获取的数据进行客观分析，不仅可以对多个指标进行统计分析，而且还可将图谱信息量化，使其可被计算机识别、处理，并以此客观地反映中药的质量信息，从而达到全面控制中药质量的目的[33]。
本研究采用超快速气相电子鼻技术对不同产地荆芥穗的图谱数据进行采集，并通过与AroChemBase数据库对比得到样品中可能存在的化合物信息。结果显示，经与数据库对比，共从16个共有峰中挖掘出13个可能存在的化合物，不同产地荆芥穗可能存在的成分及感官描述信息基本相同，仅含量存在一定的差别;甲酸甲酯、α-蒎烯、3-壬酮及α-松油醇可能为区分不同产地荆芥穗的关键因素。同时，本研究还结合PCA、DFA和CA等化学计量学方法对荆芥穗的气味特征进行研究。PCA结果显示，PC1的贡献率为88.949%，PC2的贡献率为7.858%，两者的累计贡献率为96.807%;DFA结果显示，相同产地样品间的距离缩小，不同产地样品间的距离增大;表明PCA和DFA方法可以准确、有效地区分不同产地荆芥穗。CA结果显示，15批荆芥穗可聚为3类，B1～B5、J1～J3聚为一类，A1～A3聚为一类，G1、G2、N1、N2聚为一类，表明河北产荆芥穗和江苏产荆芥穗的气味信息差异较小，甘肃产荆芥穗和河南产荆芥穗的气味信息差异较小，而安徽产荆芥穗与其他4个产地的荆芥穗气味信息差异明显。上述结果提示，PCA、DFA和CA均可对不同产地荆芥穗进行区分，且3种方法的结果基本一致。
由于荆芥穗产地较多，本研究仅收集到部分产地的样品，故所得研究结果仅表示在当前收集的样品范围内，荆芥穗的气味变化与其产地环境相关，后续还需收集足够多的具有代表性的不同产地的样品进行统计分析。此外，在后续研究中，本课题组还将尝试其他化学计量学方法（如线性判别分析、人工神经网络等）来优化和完善荆芥穗的产地鉴别模型，以提高模型的鉴别能力，为建立科学的荆芥穗质量控制评价体系提供依据。
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（收稿日期：2021-05-11 修回日期：2021-08-02）
（编辑：陈 宏）
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