副溶血性弧菌能力验证及分析
范鹏飞 顾春华 杨陶丽薇 燕妮 郭娇娇 杨雅珺
副溶血性弧菌是一种嗜盐性细菌，主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。该菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，海水中可存活47天。进食含有该菌的食物可致食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒。因此，加强对食品中副溶血性弧菌的检测十分重要。
能力验证是检验检测水平的有效手段，能够提高实验室的检测能力，对于一些不经常检测的项目，更需要能力验证来检验检测的科学性。我们采用GB4789.7-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》，在确证试验中采用了BD与VITEK 2两种全自动微生物菌种鉴定系统，用实时荧光PCR进行结果验证。结果显示，样品20-T966、20-S861均检出副溶血性弧菌，结果评价满意。所以，通过传统生化鉴定、全自动微生物菌种鉴定系统与实时荧光PCR相结合的方法，提高了检验结果的准确率，通过能力验证活动，提升了检验人员的检测能力，可以为能力验证活动及食品中副溶血性弧菌检测提供指导。
一、试剂、材料与方法
1.试剂。样品20-T966、20-S861（中国检验检疫科学研究院测试评价中心发放）;副溶血性弧菌标准菌株ATCC17802（广东微生物研究所）;弧菌显色培养基（法国科马嘉公司）;TCBS琼脂、3%氯化钠三糖铁琼脂、3%氯化钠碱性蛋白胨水、3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、氧化酶试剂、革兰氏染液、ONPG试剂、Voges-Proskauer（V-P）试剂、副溶血性弧菌生化鉴定试剂盒（北京路桥技术股份有限公司）;NID鉴定板（美国碧迪公司）;GN卡（法国生物梅里埃公司）;DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。
2.材料。IPP260plus生化培养箱（德国美墨尔特公司）;CL-32L高压灭菌器（日本ALP公司）;AC2-5S1生物安全柜（新加坡艺思高科技有限公司）;VITEK 2 compact细菌生化鉴定仪（法国生物梅里埃公司）;Phoenix M50全自动菌种鉴定仪（美国碧迪公司）;RVC2-25CDplus真空离心浓缩仪（德国Chist公司）; BX53 DP74荧光显微成像系统（日本奥林巴斯株式会社公司）;viia7实时荧光定量PCR检测系统（美国Life公司）;simplicity uv超纯水仪（德国默克密理愽公司）;ndo全波长超微量分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司）。
3.方法。（1）样品的复原。按照参试指导书进行。用酒精棉球消毒西林瓶外部，小心打开西林瓶，立即加入5mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水进行水化，待溶解后吸出放入无菌瓶中，再反复用余下的3%氯化钠碱性蛋白胨水清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入无菌瓶中，总共60mL，此溶液即是待测样品原液。
（2）增菌。以无菌操作从制取的60mL待测样品原液中吸取样品25mL，加入盛有225mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的均质袋中，均质器均质1min，制备成1∶10（体积比）的样品匀液，制备的样品匀液于培养箱中36℃培养18h。
（3）分离纯化。用接种环沾取一环增菌液，于TCBS平板和弧菌显色培养基平板上划线分离。于36℃±1℃培养18-24h。
同时复苏标准菌株，并划线于TCBS平板、弧菌显色平板和TSA平板。典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm-3mm，在显色平板上呈淡紫色菌落。每个样品挑取4个可疑菌落划线于TSA平板进行纯化。
（4）初步鉴定。①氧化酶实验。生理盐水浸湿氧化酶试纸，放入无菌的培养皿中，用一次性接种环蘸取TSA平板上纯化的菌落，研磨于氧化酶试纸上。如果滤纸在10s之内出现紫色或紫红色，即可判定氧化酶试验阳性，不变色为氧化酶试验阴性。若氧化酶试验阳性，则说明有副溶血性弧菌。②涂片镜检。用接种环蘸取纯化后的可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞、有鞭毛。③3%氯化钠三糖铁试验。用接种针蘸取纯化后的可疑菌落，划线于3%氯化钠三糖铁琼脂斜面，并穿刺底层，但不要穿刺到底部。副溶血性弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂斜面颜色不变或产碱红色加深，底层产酸培养基变为黄色，无气孔。
（5）确定鉴定。将可疑单菌落纯化后，用接种环挑取新鲜培养物至10mL的0.85%生理盐水中，仔细研磨，与标准0.5麦氏浊度比浊管比较，制成0.5个麦氏浊度的均匀菌悬液，按照生化鉴定试剂盒使用说明书加入到相应生化反应孔中，36℃培养18-24h后，按照说明书观察结果。
（6）全自动微生物菌种鉴定系统。①BD全自动微生物菌种鉴定系统。纯化后的菌用接种环挑到4.5mL的Phoenix ID肉汤管中，制成0.5McFarland的菌懸液，倒入NID卡后封盖，放入BD机箱中进行鉴定。每个菌鉴定两次。②VITEK 2全自动微生物菌种鉴定系统。纯化后的菌用接种环挑到盛有3.0mL无菌盐水的透明的塑料管中，制成0.5 McFarland的菌悬液，放入GN鉴定卡，最后放入VITEK 2 COMPACT中进行鉴定。每个菌鉴定两次。
4.实时荧光定量PCR验证。（1）DNA提取。将分离纯化的单菌落接种到5mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水试管中，36℃培养18h，取1mL菌悬液加入到1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，移去上清液，加入1mL无菌超纯水混匀后离心，移去上清液。加入50μL DNA提取液混匀，室温放置10min后进行沸水浴10min，13000r/min离心5min，将上清液转移至新管备用。
（2）引物与探针。采用Tamman方法。Taqman探针：5"-ATCCATCGTGGCGGTCATATCCAC-3" ，探针5"端由FAM标记，3"端由TAMRA标记。上游引物：5"-CGGTAGTAAACCCACTGTCAG-3"，下游引物：5"-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3"。
（3）PCR扩增。反应体系的配置：H2O 3.0μL、Template 4.0μL、Premix Ex Taq 10.0μL、Rox Ⅱ0.4μL、Probe 1.0μL、Primer各0.8μL;反應条件：第一阶段，预变性93℃，2min;第二阶段，93℃ 45s，55℃ 60s，10个循环;第三阶段，93℃ 30s，55℃ 45s，30个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。
二、结果与分析
1.菌落形态及菌体形态。样品20-T966、20-S861与标准菌的菌落形态一致，符合副溶血性弧菌在TCBS与弧菌显色培养基上的典型菌落形态（见表1）。经革兰氏染色，在100倍油镜下观察（见图1），菌体为革兰氏阴性菌，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞。
2.生化鉴定。样品20-T966和20-S861经初步生化鉴定、确证性生化鉴定，以及其他生化鉴定，其结果均符合副溶血性弧菌生理生化现象（见表2），由此可判断样品20-T966和20-S861中均含有副溶血性弧菌。
3.全自动微生物菌种鉴定。经BD与VITEK 2全自动菌种鉴定系统鉴定后，其结果均为副溶血性弧菌，置信度较高，为极好的鉴定结果（见表3）。对于BD与VITEK 2在副溶血性弧菌的鉴定中，鉴定结果准确度较高，均在96%以上，也可选择其他的生化鉴定系统进行鉴定。全自动菌种鉴定系统的关键是单菌落的纯化，并用非选择性培养基进行增菌，比浊仪每次使用时都应用标准比浊管进行校正，菌悬液调到合适的麦氏浊度范围。
4.实时荧光PCR验证。样品20-S861能够呈S型曲线特异性扩增，如图2所示。样品20-T996能够呈S型曲线特异性扩增，如图3示。阳性对照能够呈S型曲线特异性扩增，空白对照和阴性对照无扩增，如图4所示。根据SN/T 2424-2010《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法 实时荧光PCR方法》中6.1.3中的结果描述及判读，所以样品20-S861和20-T966中均检出副溶血性弧菌。
三、结论与讨论
能力验证是检验检测水平的有效手段，能够提高实验室的检测能力，对于一些不经常检测的项目，更需要能力验证来检验检测的科学性。本次申请了能力验证食品中副溶血性弧菌（定性）检测项目，在检验过程中除了常规的生理生化确证外，使用了BD与VITEK 2两种全自动微生物菌种鉴定系统进行相互比较验证，加入了分子生物学方法实时荧光PCR进行确证。最后综合得出检验结果，样品20-S861与样品20-T966均检出副溶血性弧菌，反馈结果为满意。此次能力验证活动，提升了检验人员对副溶血性弧菌的检测能力，提高了实验室竞争力，可以为副溶血性弧菌能力验证和日常的食品检验提供指导。
作者简介：范鹏飞，本科，助理工程师，主要研究方向为食品微生物检测。
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