厄贝沙坦联合表柔比星对乳腺癌细胞增殖的抑制作用及对survivin和VEGF表达的影响
欧夏妙 钟全强 唐景财 吴洪文
【摘要】 目的 研究厄貝沙坦联合表柔比星对MCF-7乳腺癌细胞增殖抑制作用及对生存素（survivin）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响。
方法 采用MTT（噻唑蓝）法检测不同剂量表柔比星及厄贝沙坦联合表柔比星对乳腺癌MCF-7细胞分别作用24 h、48 h、72 h后的抑制率，用ELISA法（酶联免疫吸附法）检测空白对照组、表柔比星组（0.75 μg/mL）、表柔比星联合厄贝沙坦组（0.75 μg/mL+2.3 μg/mL）、顺铂阳性对照组（5 μg/mL）各组药物作用下细胞培养基中VEGF及survivin的表达水平。
结果 表柔比星对乳腺癌MCF-7细胞的半数抑制浓度（IC50）为0.75 μg/mL，厄贝沙坦联合表柔比星对细胞增殖有显著抑制作用，且随着浓度的增加而增强，三个剂量组和空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。联合用药组与单用表柔比星组及阳性对照组分别作用24 h、48 h、72 h后与对照组比较VEGF的表达差异均无统计学意义（P>0.05）。表柔比星联合厄贝沙坦组中survivin表达水平与空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），作用72 h后联合用药组与阳性对照组相比较，survivin的表达差异有统计学意义（P<0.01），联合用药组作用48 h、72 h和表柔比星组比较survivin的表达差异有统计学意义（P<0.01）。
结论 厄贝沙坦联合表柔比星对乳腺癌MCF-7细胞的增殖具有显著抑制作用，可以下调survivin的表达水平。
【关键词】 厄贝沙坦;表柔比星;乳腺癌MCF-7细胞;抑制作用
中图分类号：R737.9 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.05.002
【Abstract】 Objective To study the inhibition effect of irbesartan combined with epirubicin on proliferation of breast cancer cells and its influence on the expressions of survivin and vascular endothelial growth factor （VEGF）.
Methods MTT （Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide） method was used to detect the inhibition rate of different dose of epirubicin and irbesartan combined with epirubicin on MCF-7 cells of breast cancer after action of drugs for 24 h， 48 h and 72 h， respectively. ELISA （enzyme linked immunosorbent assay） was used to detect the expression levels of survivin and VEGF in cell culture medium under the action of drugs among blank control group， epirubicin group （0.75 μg/mL）， epirubicin combined with irbesartan group （0.75 μg/mL + 2.3 μg/mL） and cisplatin positive control group （5 μg/mL）.
Results The inhibitory concentration 50% （IC50） of epirubicin on MCF-7 cells of breast cancer was 0.75 μg/mL， irbesartan combined with epirubicin had a significant inhibitory effect on cell proliferation， which increased with the increase of concentration， and difference between the three dose groups and the blank control group was statistically significant （P < 0.05 or 0.01）. After action of drugs for 24 h， 48 h and 72 h， difference of VEGF expression levels between the epirubicin group， the cisplatin positive control group and the blank control group was not statistically significant （P > 0.05）. Difference of the expression levels of survivin between the epirubicin combined with irbesartan group and the blank control group was statistically significant （P < 0.05）. After action of drugs for 72 h， difference of the expression levels of survivin between the combined medication group and the blank control group was statistically significant （P < 0.01）. And action of drugs for 48 h and 72 h， difference of the expression levels of survivin between the combined medication group and the epirubicin group was statistically significant （P < 0.01）.
Conclusion Irbesartan combined with epirubicin can significantly inhibit the proliferation of MCF-7 cells of breast cancer and down-regulate the expression level of survivin.
【Key words】 irbesartan; epirubicin; MCF-7 cells of breast cancer; inhibitory effect
生存素（survivin）是目前研究發现的肿瘤细胞凋亡抑制因子中功能最强的，属于凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族中的新成员，survivin通过有丝分裂对细胞增殖起到促进作用，从而抑制细胞凋亡，同时还具有调节细胞分裂的双重功能[1]，survivin基因在肿瘤的形成、进展过程中对细胞周期起正性调节作用，从而促进了肿瘤的生长[2]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是调节肿瘤细胞中血管生长的重要因子之一[3]。许多肿瘤细胞组织中VEGF呈高表达[4]。本课题前期研究表明：厄贝沙坦对乳腺癌MCF-7细胞的增殖具有显著抑制作用，可以下调VEGF的表达水平[3]。此次研究进一步探讨厄贝沙坦联合表柔比星对MCF-7乳腺癌细胞增殖的抑制作用及对VEGF和survivin表达的影响，进一步为临床抗肿瘤靶向治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂
顺铂注射液购自江苏豪森药业股份有限公司;厄贝沙坦购自浙江华海药业股份有限公司;胎牛血清、胰岛素和DMEM培养基均购自杭州四季青生物工程公司：DMEM加1.0 mM丙酮酸钠，0.1 mM非必需氨基酸和1.5 g/L碳酸氢钠，添加0.01 mg/mL胰岛素和10%胎牛血清。VEGF试剂盒、survivin试剂盒和ELISA（酶联免疫吸附测定法）试剂盒均购自江苏凯基生物科技有限公司（2～8℃保存）。
1.1.2 试验细胞
乳腺癌MCF-7细胞株购自上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（试验前，细胞保存于液氮罐中）。
1.1.3 仪器
倒置相差显微镜（日本Olympus公司），MODEL550酶标仪（美国BIORAD公司），CO2培养箱（美国thermo forma公司）;超净工作台（苏州净化设备厂）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
该研究中的MCF-7细胞株经过复苏后，转移至培养瓶中，置于37℃，0.5%CO2的细胞培养箱中进行培养，胰酶消化后的细胞，经过传代培养后，将处于对数生长期的MCF-7细胞进行种板，细胞计数板在显微镜下进行计数，将96孔板中肿瘤细胞密度调至约5000个/孔。
1.2.2 MTT法检测细胞存活率
分别设置表柔比星高剂量组、中剂量组、低剂量组三个组及空白对照组，表柔比星给药剂量分别为1.2 μg/mL、0.6 μg/mL、0.3 μg/mL，空白对照组给药浓度为0 μg/mL[5];另外，分别设置表柔比星联合厄贝沙坦高剂量组、中剂量组、低剂量组三个组及空白对照组，表柔比星+厄贝沙坦给药剂量分别为（1.2+2.4） μg/mL、（0.6+1.2） μg/mL、（0.3+0.6） μg/mL，空白对照组给药浓度为0 μg/mL。MTT法测定表柔比星及表柔比星联合厄贝沙坦对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响：在表柔比星高剂量组、中剂量组、低剂量组三个组对乳腺癌细胞作用24 h、48 h、72 h后测抑制率，运用MTT法检测表柔比星三个剂量组干预后，用酶标仪以570 nm/630 nm双波长测定各组细胞吸光度（A）值，细胞增殖抑制率=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100%。重复上述试验3次，Bliss法计算半数抑制浓度（IC50）值。根据IC50值设定后续试验的作用浓度[5]。
1.2.3 采用ELISA方法检测各组中VEGF及survivin的表达
试验分为空白对照组、表柔比星组（0.75 μg/mL）、表柔比星联合厄贝沙坦组（0.75 μg/mL+2.3 μg/mL）、顺铂阳性对照组（5 μg/mL），以未给药物培养液作为空白对照组。采用双抗夹心法分别测定各组药物作用下细胞培养基中VEGF及survivin表达水平，检测步骤均严格按照试剂盒说明书操作步骤实行，在450 nm波长下测量样本的吸光度值（A），测定的最小值为20 pg/mL，VEFG及survivin的含量均按照标准曲线进行换算得到。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，数据结果均以（±s）表示，各实验组间比较采用方差分析进行检验，进一步比较采用q检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。
2 结 果
2.1 MTT法的测定结果
经系统软件计算，表柔比星对乳腺癌MCF-7细胞的半数抑制浓度（IC50）为0.75 μg/mL，在相同作用时间下，随着表柔比星给药浓度的增加，其对MCF-7细胞增殖抑制作用逐渐增强（P<0.05），在高、中、低三个剂量组和联合用药三个剂量组中，随着用药时间的延长，其对MCF-7细胞增殖抑制作用逐渐增强（P<0.05）。见表1、表2。
2.2 ELISA方法测定各组中VEGF及survivin的表达结果
从表3对VEGF表达水平测定结果可以看出：表柔比星组、联合用药组和顺铂阳性对照组分别作用24 h、48 h、72 h后比较VEGF表达差异均无统计学意义（P>0.05）。从表4对survivin表达水平的测定可以看出：联合用药组作用72 h与阳性对照组作用72 h相比较，survivin的表达差异有统计学意义（P<0.01），联合用药组作用48 h、72 h和表柔比星组比较，survivin的表达差异有统计学意义（P<0.01）。
3 討 论
国外研究表明survivin在大多数乳腺癌中呈过度表达，而VEGF在胰腺癌等多种恶性肿瘤中高表达，这一过程导致了耐药性的产生[2]。CHEN等[4]相关学者对survivin和VEGF因子与肿瘤相关的研究报道指出，survivin是血管生成过程中内皮细胞表达的一种新的生长因子诱导保护基因，VEGF通过PI3K/Akt途径诱导survivin表达。结果显示survivin和VEGF在SCLC（小细胞肺癌）中的表达呈正相关，survivin和VEGF的过度表达可能在SCLC的发生发展中起着重要的作用，并可作为判断肿瘤预后的重要分子标志物。
国外相关研究[5～8]认为survivin在肿瘤中大量表达，与许多人类肿瘤预后不良有关。这种凋亡抑制剂在促进癌细胞存活和抑制细胞凋亡中都有相关作用。因此，异常survivin表达刺激肿瘤进展，并对多种肿瘤的几种治疗策略产生抵抗[9～11]。有效下调survivin或抑制导致自发凋亡或对化疗和放疗敏感[12～13]。因此，所有这些特征使survivin成为一个有吸引力的癌症治疗靶点[14～16]。
本次研究针对survivin和VEGF这两种表达因子进行了更进一步的研究，结果表明：表柔比星高、中、低三个给药剂量组对乳腺癌MCF-7细胞的增殖具有显著抑制作用，在ELISA方法测定各组结果中显示：随着给药时间的延长，表柔比星组、联合用药组与空白对照组对比较，survivin的表达均具有显著差异，其中，联合用药组作用72 h与阳性对照组作用72 h相比较，survivin的表达有显著差异，而且对survivin因子的下调作用随着作用时间的延长而增加，从单组数据分析，联合用药组可以下调VEGF表达，但对数据结果进行统计学分析后发现，用药后24 h、48 h、72 h比较，VEGF的表达水平均无统计学意义，该试验数据结果可能与培养细胞过程中样本量较小有关，在后续研究中可以加大样本数量，优化和完善试验条件，对结果进行验证。
据本次研究结果推测，厄贝沙坦对MCF-7细胞的增殖抑制作用可能与下调VEGF因子[3]及survivin因子作用机制有关，本次研究结果也表明：联合用药组（表柔比星联合厄贝沙坦）与单用表柔比星组分别作用24 h、48 h、72 h对survivin表达作用差异显著，这一结果提示：表柔比星联合厄贝沙坦对降低化疗药的给药剂量，减轻化疗药物毒性具有潜在可能，同时也可能减少治疗过程中肿瘤细胞的耐药性，还可能为新的联合化疗方案提供理论依据。
参 考 文 献
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（收稿日期：2019-10-30 修回日期：2021-04-23）
（編辑：潘明志）
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